腫瘤免疫治療中的雙特異性抗體（一）

在過去的幾年里，抗體免疫療法給腫瘤治療到來了革命性的改變，這主要體現在超級耐受和長期生存的明顯改善。第一款上市的腫瘤免疫治療抗體是針對CTLA-4的免疫抑制劑ipilimumab ,2011年獲準治療黑色素瘤，緊隨其后的是2014年上市的PD-1抗體nivolumab 和pembrolizumab ，以及2016-2017年上市的PD-L1抗體atezolizumab, avelumab 和durvalumab ，截止目前，腫瘤免疫治療抗體已獲準適用于多種腫瘤類型，包括黑色素瘤，霍奇金淋巴瘤，默克爾細胞腺瘤，非小細胞肺癌，頭頸癌，腎癌，膀胱癌，結腸癌，肝癌，胃癌和食管癌。

在轉移性黑色素瘤中，長期存活（超過三年），ipilimumab抗體治療響應率接近20%，PD-1抑制劑響應率在35-50%。盡管單克隆抗體免疫治療取得的成績是喜人的，但是不可否認的是絕大多數患者對于單抗免疫治療仍然無反應。另外，免疫相關不良事件如結腸炎，腹瀉，皮膚毒性，內分泌病，肝毒性，肺炎等限制了免疫治療單克隆抗體在臨床中的應用。聯合療法似乎比單一療法更能提高患者的長期存活率，但療效的提高是以副作用為代價的。

雙特異性抗體在臨床有效性和安全性方面更具潛力，因此被稱為下一代免疫療法。近年來，雙特異性抗體有了長足的發展。目前，已有眾多雙特異性抗體處在臨床和臨床前研究階段。這里面占據主導位置的雙特異性抗體還是靶向CD3，T細胞重定向和靶向腫瘤抗原的雙特異性抗體。這一概念建立在這樣一個事實上，即雙特異性抗體將通過CD3結合并激活T細胞，并通過腫瘤抗原結合特性將這些T細胞重定向到腫瘤區域。這種方法的一個明顯缺點是CD3會不加選擇地招募T細胞。因此，我們現在看到第二代雙特異性抗體的出現，新的方法正在探索，以實現更有選擇性的招募和激活腫瘤特異性T細胞，或更強大的免疫調節靶向兩個不同的免疫調節途徑。

雙特異性抗體可以看作是兩種治療藥物合并成一個更好的實體，擁有兩種藥物的效果。表面上來看，這似乎已經達到了雙特異性抗體的最終目的，但僅僅是兩種抗體的簡單組合是遠遠不夠的。事實上，大多數公司開發雙特異性抗體的目的是產生一種性能優于兩種單特異性藥物組合的藥物，或者是創造一種僅靠單特異性抗體混合物無法實現理想治療療效的藥物。

因此，雙特異性抗體的評判標準是很高的，這就意味著雙特異性抗體藥物的研發所需要考慮的因素較傳統單克隆抗體藥物研發還要多的多。為了獲得理想的臨床效果和安全性，同時考慮到可開發性和制造成本，不同形式的雙特異性抗體的固有屬性必須仔細考慮比較。此外，雙特異性抗體針對兩個靶點的劑量控制不能像聯合用藥一樣自由控制，都需要提前考慮兩個靶點抗體相對親和力的比例。另一方面，雙特異性抗體較同時研發兩種單克隆抗體藥物復雜程度和工作量上有所降低，例如，在建立劑量考慮方面無需考慮二者聯合用藥的比例。除此之外，每一個雙特異性抗體藥物的研發都必須基于合理的生物學原理。

雙特異性抗體較單抗聯合用藥的最大益處在于有效性和安全性。雙特異性抗體一定程度上提升了有效性。其中一種設計理念是細胞毒性效應細胞的重定向作用，包括T細胞或NK細胞的重定向，該類雙特異性抗體使得毒性效應細胞重定向于表達特異性腫瘤抗原的惡性腫瘤細胞。另一個類似的設計理念是靶向腫瘤免疫調節劑，該類雙特異性抗體主要集中在激活腫瘤區域的藥理學作用，因此與全身的系統免疫調節相比更具有效性，而且毒副作用相對較低。第三種設計理念是雙免疫調節劑，該類雙特異性抗體可以同時激活兩個不同的調節通路，類似于兩種藥物的聯用，同時也賦予了額外的協同作用，起到了兩種藥物聯用無法企及的新的生物學效應。例如，增加細胞與細胞的相互作用，共刺激受體的聚集，可以增加免疫突觸的穩定性，從而觸發下游信號通路。

雙特異性抗體的功能特性，以及最終的臨床成功取決于三個主要因素:(1)生物學原理;(2)雙特定抗體的形式;(3) Fc結構域的存在與否在及其性質。

生物學原理

生物學原理考慮了生物學靶點，功能模型，以及結合特性。對于靶向腫瘤抗原，T細胞或NK細胞重定向的雙特異性抗體構建來說，腫瘤抗原的靶點選擇非常重要。腫瘤抗原的表達模式影響著雙特異性抗體的安全性和有效性，理想的腫瘤抗原在腫瘤細胞表面高表達，而在正常組織中不表達。其次，首選的免疫激活靶點，需要適應腫瘤抗原和靶點適應癥的選擇。例如，可以提出這樣的假設，利用CD3激活的T細胞重定向可能更適合于血液腫瘤，像臨床藥物blinatumomab 和catumaxomab 那樣發揮臨床作用，盡管目前的一些在研雙特異性特異性抗體希望能夠解決實體瘤治療的問題。相對比，靶向4-1BB可以有效即激活腫瘤特異性浸潤T淋巴細胞,可能更適宜于實體瘤治療，通過靶向4-1BB，靶向腫瘤免疫調節，優先激活浸潤腫瘤T細胞，達到治療實體瘤的目的。對于雙調節的雙特異性抗體，相對于兩個單靶點藥物聯合使用來說，雙靶點可誘導超級免疫效應，這是很重要的一個方面。有時候雙特異性抗體兩個靶點的選擇很難預測，需要大量的篩選雙特異性抗體，以達到理想的雙特異性抗體的治療療效。最后，兩個靶點的親和力以及病人兩個靶點分子的表達分度同時影響著雙特異性抗體效應的安全性，用藥劑量等。例如，T細胞重定向的雙特異性抗體一般擁有針對腫瘤抗原相對CD3較高的親和力，可以有效激活局部T細胞，降低靶向系統性CD3的毒性。

雙特異性抗體的形式

雙特異性抗體除了擁有各種各樣的生物學功能特性外，還具有多種物理學特性，比如大小，結合價位，等電點，雙特異性抗體的形式影響著雙特異性抗體的功能和療效。不同的雙特異性抗體形式已在好多文章中報道過，這里不再一 一展開，但是一些代表性的形式，不同的使用方法以及潛在的影響在本文的后續內容中都有所討論。

Fc結構域

雙特異性抗體形式的選擇對雙特異性抗體的功能和活性都有影響，這其中很重要的一個方面是所選雙特異性抗體形式中是否含有Fc段結構域。Fc段賦予了雙特異性抗體更多的生物學功能，包括與新生兒Fc受體FcRn的結合延長了血清半衰期，擁有抗體依賴的細胞毒性ADCC作用，補體依賴的細胞毒性作用CDC。根據作用模型設計，靈活采用不同的方法。綜合目前雙特異性抗體構建的考慮，主要包括：缺乏Fc結構域的小分子雙特異性抗體，同時缺乏Fc，半衰期短，保留與FcRn受體結合作用，但ADCC,CDC作用降低的突變Fc結構域，擁有野生型Fc結構域或者增強與FcγR和/或C1q親和力作用的突變Fc結構域，一些實例將在下文中列舉。

根據生物靶點類型和作用方式，雙特異性免疫治療可分為三大類(表1):

（1）細胞毒性效應細胞重定向

（a）T細胞重定向

（b）NK細胞重定向

（2）腫瘤靶向免疫調節劑

（3）雙免疫調節劑

在這些類型中，T細胞重定向免疫治療發展最為迅速，其它兩類雙特異性抗體還處在臨床研發階段，除此之外的雙特異性抗體還處在早期研究和發現階段，還未進入臨床試驗階段。

細胞毒性效應細胞重定向

T細胞重定向。T細胞重定向雙特異性抗體主要針對腫瘤表面特異性抗原和TCR-CD3復合物，重定向毒性T細胞到惡性腫瘤細胞。在該類雙特異性抗體治療中，T細胞激活與抗原特異性無關，T細胞池中的大多數T細胞被激活（圖1）。T細胞重定向的概念提出來已有很多年了，而且這一概念已很好的應用于臨床，例如blinatumomab.雙抗。然而，只有少部分的T細胞重定向雙特異性抗體上市或者進入后期臨床研究，很可能歸因于其明顯的毒性，制造工藝問題，免疫原性，以及在實體瘤中的低響應率。

表1.各種免疫治療雙特異性抗體的概述，包括每種抗體的例子

T細胞重定向治療的獨特特點包括通過TCR參與，不依賴于腫瘤特異性，以及對CD3介導的激活高度敏感。另外，多數T細胞重定向治療不依賴于共刺激因子CD28或IL-2。據推測，所謂的BiTEs分子可能在誘導的免疫突觸內聚集TCR-CD3復合物，在沒有共刺激的情況下觸發信號。另一種假設是，記憶T細胞是T細胞重定向介導的細胞毒性的主要效應細胞，因為它們似乎需要較少的刺激就能完全激活。由T細胞重定向介導的T細胞活化可以在非常低的抗體劑量或低表達水平的腫瘤抗原下實現，每個細胞有數百至數千個腫瘤抗原。

然而，T細胞定向治療往往具有次優的抗腫瘤作用。這些雙特異性抗體可能主要對表達特定靶抗原的腫瘤細胞有效，表達低水平抗原的腫瘤細胞幸存下來，導至腫瘤僅部分被殺死，產生治療抗性。此外，T細胞的抗原不依賴性激活導至了一個大T細胞池的快速和強大的激活，這可以解釋這類雙特異性抗體的毒性。對這類T細胞重定向雙特異性抗體的毒性觀察，有利于進一步對該類雙特異性抗體T細胞激活和劑量使用機制的研究，以便支持后續治療安全性和有效性的提升。盡管存在挑戰，該類雙特異性抗體近年來已有長足發展。兩種T細胞重定向雙特異性抗體已上市, blinatumomab (Blincyto?) 和 catumaxomab
(Removab), 2017年6月，catumaxomab退出市場。另外，目前擁有超過25種T細胞重定向雙特異性抗體進入臨床Ⅰ期試驗，涉及的適應癥包括血液腫瘤和實體瘤。

Blinatumomab 是靶向CD19-CD3的BiTE雙特異性抗體，批準用于B細胞急性淋巴性白血病（B-ALL）,目前正在進行其它血液腫瘤的臨床Ⅰ和Ⅱ期研究，例如B細胞淋巴瘤[ClinicalTrials.gov identifier: NCT01741792] ，非霍奇金淋巴瘤[ClinicalTrials.govidentifier: NCT02811679] ，多發性骨髓瘤[ClinicalTrials.gov identifier: NCT03173430] 。該分子是串聯的SCFV形式，缺乏Fc結構域，血清半衰期僅2h。短暫的血清半衰期對于該藥物的毒副作用來說有利，因為體內很容易清除。然而，短暫的半衰期給用藥劑量和給藥方式帶來了不便。治療Blincyto的一個周期由4周連續靜脈滴注接著是2周無治療間隔期。在最近一期單藥免疫治療復發或難治性ALL的III期試驗中，與化療相比，blinatumomab顯示出顯著的生存獲益，且血液緩解率明顯高于常規化療，生存期明顯長于常規化療。

Catumaxumab是一種EpCAM-CD3雙特異性抗體，用于治療惡性腹水。該雙特異性抗體形式與Blinatumomab完全不同。該雙特異性抗體是完整的全長非對稱IgG形式，分別擁有針對兩個靶點各自的一條輕鏈和重鏈。該雙特異性抗體的兩條重鏈和輕鏈分別來自于大鼠和小鼠，除了CD3介導的T細胞激活以外，該抗體還擁有FcγR介導的生物學功能，以及大鼠/小鼠源所帶來的免疫原性。

NK細胞重定向。利用毒性T細胞重定向殺傷腫瘤細胞的替代是重定向毒性NK細胞到惡性腫瘤細胞。一些靶向激活毒性效應NK細胞的受體已經報道過，包括CD16 (FcγRIII), NKp30, NKp46, NKG2D, 和DNAM-1。迄今為止很少有重定向NK細胞的雙特異性抗體報道。這其中的一個例子是AFM13 ，一個靶向CD30-CD16A的雙特異性抗體以四價形式構造。CD16A,或者稱作為FcγRIIIA ，是表達于NK細胞或巨噬細胞表面的FcγR,通過結合與抗原相互作用的抗體的Fc結構域，CD16A介導抗原表達細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。AFM13中，重定向的NK細胞對于表達CD30的淋巴瘤細胞執行NK細胞具有的細胞毒性功能。與其他CD16結合抗體性比，AFM13具有的與CD16結合后緩慢的解離速率，延長了藥物的作用時間，提高了腫瘤殺傷的效率。在Ⅰ期臨床試驗中，AFM13表現出明顯的臨床療效，激活了NK細胞，可溶性CD30降低。另外，該雙特異性抗體耐受性好，數據顯示重定向NK細胞治療在耐受性方面優于T細胞重定向治療。AFM13 進入臨床Ⅱ期研究，其它兩種針對CD16A的雙特異性抗體AFM24,AFM26分別靶向EGFR或BCMA正在進行臨床前研究。

除了重定向雙特異性抗體，一些公司還在探索研究三，四特異性策略，來提高NK細胞的激活和選擇性殺傷作用。一個概念化設計TriFlex 形式，該三特異性抗體可以靶向腫瘤抗原BCMA和CD200,借助靶向CD16重定向NK細胞，起到選擇性殺傷腫瘤細胞的作用。其它的一些概念化設計例子包括TriKE 和 TetraKE, 在借助CD16重定向CD16的同時，借助IL-15進一步提升NK細胞的殺傷活性。

圖1.T細胞重定向作用