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以小鼠腹水型肝癌細胞亞系Hca/16A<,3>-F為細胞株，建立小鼠皮下種植瘤模型，用依托泊苷Vp-16治療，誘導該腫瘤細胞耐藥，一周后建立耐藥模型，再用重組人腫瘤壞死因子α衍生物K2Rh-TNFα-Dk2治療，通過電鏡下的形態學觀察以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2的蛋白表達情況，來研究TNF-α能否誘導對Vp-16耐藥的腫瘤細胞凋亡，為克服耐藥尋找新的途徑。
方法：
1，Hca/16A<,3>-F細胞復蘇后取第二代腹水，離心后用生理熱水調整腫瘤細胞濃度為1×10<6>/0.2ml，615小鼠右側腋下皮下注射接種，每只0.2ml，接種后第5～7d出現腫瘤，待種植瘤長至6～10mm時，將小鼠隨機分為4組：陰性對照組小鼠自然生長、陽性對照組Vp-16、單藥組Rh-TNFα-Dk2和聯合組Vp-16+Rh-TNFα-Dk2，每組20只，雌雄各半。
2，各組自接種第8d開始給藥，均為瘤內注射。
3，Vp-16連用3d，Rh-TNFα-Dk2連用8d。,
4，聯合組小鼠應用兩種藥物須間隔一周。
5，從治療開始的前1d種瘤第7d，即用游標卡尺測量皮下種植瘤的最長徑及與之垂直的最寬徑，每隔1d測量并記錄，計算瘤體直徑均值。
6，接種第28d隨機脫頸處死各組一半的小鼠，稱取瘤重，計算質量抑瘤率。
7，取新鮮瘤組織，一部分用10﹪的甲醛固定，常規石蠟包埋，連續4μm切片，用于HE染色常規病理學檢查和免疫組織化學染色，檢測bcl-2和bax蛋白在腫瘤組織中的表達情況。
8，另一部份用戊二醛固定，常規制備透射電鏡標本，超薄切片機切片，透射電鏡下觀察各組瘤細胞的凋亡情況的差異。
9，各組另一半小鼠在相同條件下喂養，觀察各組小鼠生存期的長短。,
結果:
1，由于Vp-16和TNF-α的副作用，Vp-16組、FNF-α組及聯合組均有不良事件發生。
2，各組荷瘤大小：
治療前種瘤第7d：
各組之間瘤體直徑均值比較均P>0.05，無統計學差異；種瘤第10d：
聯合組和陰性對照組比較P<0.05，有統計學差異，和Vp-16組、TNF-α組比較P>0.05，沒有統計學差異；種瘤第16d及22d：
聯合組和陰性對照組、TNF-α組比較P<0.01、P<0.05，有統計學差異，和Vp-16組比較P>0.05，沒有統計學差異；種瘤第28d：
聯合組和陰性對照組、TNF-α組比較均P<0.01，有統計學差異，和Vp-16組比較P>0.05，沒有統計學差異；種瘤第34d：
聯合組和陰性對照組、TNF-α組比較均P<0.01，和Vp-16組比較P<0.05，差異顯著，有統計學意義。
3，第28d處死小鼠時的瘤重及抑瘤率：
在第28d，各組之間瘤重比較均P<0.01，差異顯著，有統計學意義。
Vp-16組、TNF-α組、聯合組的抑瘤率分別為48.97﹪、24.20﹪、72.49﹪。
可以看出聯合組在控制瘤重方面優勢最為明顯，其次為Vp-16組和TNF-α組。
4，生存期比較：
聯合組和陰性對照組、Vp-16組、TNF-α組比較，P<0.01，差異顯著，具有統計學意義。
Vp-16組、TNF-α組、聯合組的延命率分別為26.34﹪、22.76﹪、53.20﹪。
可以看出聯合組在延長生存期方面優勢最為明顯，其次為Vp-16組和TNF-α組。
5，HE染色光鏡結果：
聯合組腫瘤細胞呈片狀、條帶狀壞死，腫瘤組織細胞核碎裂、溶解，部分壞死組織呈均質紅染無結構區域，其壞死灶明顯多于Vp-16組、TNF-α組及陰性對照組。
經統計學分析，各組之間腫瘤內壞死組織面積百分比比較，均P<0.05差異顯著，具有統計學意義。
6，電鏡結果：
聯合組凋亡細胞很多，很重，很典型，并且展示了凋亡過程的不同階段。
而Vp-16組和TNF-α組鏡下所見，凋亡細胞不是很多，不典型。
陰性對照組自發凋亡的細胞更少。
7，免疫組織化學染色分析：
bcl-2蛋白的表達情況：
bcl-2蛋白的表達量最多為陰性對照組，依次為Vp-16組、聯合組、TNF-α組。
除TNF-α、聯合組之間比較P>0.05，差異沒有統計學意義之外，其他各組之間比較P<0.05或P<0.01，差異顯著，具有統計學意義。
bax蛋白的表達情況：
bax蛋白的表達量最多為聯合組，依次為TNF-α組、Vp-16組、陰性對照組。
除TNF-α、聯合組之間，Vp-16組、TNF-α組之間比較P>0.05，差異沒有統計學意義之外，其他各組之間比較均P<0.01，差異顯著，具有統計學意義。
結論:
1．聯合組在抑制腫瘤增殖方面具有明顯優勢。
2．聯合組能顯著延長荷瘤小鼠的生存期。
3．Rh-TNFα-Dk2對耐Vp-16的肝癌種植瘤除了直接的殺傷作用外，還能誘導腫瘤細胞凋亡，可能的機制為上調促凋亡基因bax的表達并下調抑凋亡基因bcl-2的表達