文章導讀
eccDNA是染色體外的一種特殊的環狀DNA，從它的出現至今已長達數年，但在起初的很長一段時間里并未得到人們的重視。隨著高通量技術的發展，eccDNA(extrachromosomal
circular
DNAs，eccDNAs)作為染色體外的環狀DNA的研究也進一步深入。在國際學術期刊《Nature》和《Cell》上相繼發表的關于eccDNA在腫瘤的發生和發展中具有重要功能的報道使eccDNA成為了基因組學研究中的一個爆點。這兩篇文章中認為eccDNA能夠促進腫瘤細胞中原癌基因的表達，這一重要發現使eccDNA成為科研界關注的熱點話題。
然而關于eccDNA在腫瘤細胞內的空間位置及作用機理仍未可知。近期，美國斯坦福大學研究團隊在bioRxiv
預先發表了一篇題目為“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene
expression”的文章，對癌癥細胞中ecDNA
hubs（ecDNA聚集成簇）在致癌基因的表達中發揮重要的作用提出了一個新的分子機制，這為解析ecDNA在癌癥細胞中的作用提出一個新方向，也為癌癥治療提供了新的理論基礎。
發表平臺： bioRxiv
發表日期： 2020.11.20
實驗方法: WGS, RNA-seq, ChIP（以上服務云序均可提供）
文章鏈接：EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression
研究內容
此前研究發現ecDNA是大小約100kb-幾Mb的雙鏈環狀DNA。由于其自身沒有著絲粒，因此在細胞分裂中可隨機分配到子細胞，這一特性使ecDNA在腫瘤耐藥性方面發揮作用。而且，ecDNA也可以重新整合到染色體上或者形成重復序列（HSRs）。此外，ecDNA相比于染色體DNA有更加松散的結構，更適于其攜帶的致癌基因的轉錄和表達。ecDNA存在于正常染色體之外，其在細胞核中的空間組織目前還不清楚。但值得注意的是，ecDNA在某些生物學過程之后會發生聚集。本文中作者展示了由10-100個ecDNA聚集組成的ecDNA簇，它們聚集在間期細胞核內，驅動分子間增強子的重排從而驅動致癌基因表達。本研究中，通過檢測在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空間、表觀和轉錄水平的動態變化，發現ecDNA hubs作為一個組合的增強子集合體，對致癌基因的轉錄發揮調控。
研究結果
（1）ecDNA hubs是癌基因轉錄的主要位點
為了了解ecDNA在轉錄過程中的空間背景，作者使用DNA熒光原位雜交技術（FISH）分別在前列腺癌（PC3）、結直腸癌（COLO320-DM）、膠質母細胞瘤（HK359）以及胃癌（SNU16）中可視化了ecDNA在間期期間在細胞核中的定位，發現這些ecDNA是幾十到幾百個聚集在間期細胞的細胞核的特定區域，這表明ecDNA
相互之間具有很強的聚集性，稱之為ecDNA hubs。為了評估ecDNA
hubs的轉錄活性，作者結合了DNA和新生RNA利用FISH檢測了在PC3和COLO320-DM細胞系中MYC等位基因的轉錄活性，發現ecDNA
hubs上致癌基因的轉錄的概率明顯高于染色體位點，且發現MYC轉錄概率與ecDNA聚類之間有顯著的相關性。因此，當更多的ecDNA在同一細胞聚集時，ecDNA
hubs更有可能轉錄癌基因。
（2）單細胞水平識別與強效癌基因表達相關的ecDNA增強子
為了了解ecDNA上致癌基因表達的調控，作者在單細胞水平上鑒定了與癌基因高表達相關的ecDNA上的調控元件并檢測了癌細胞的異質性，以及ecDNA與癌基因轉錄的關系。作者采用單細胞組學的方法，使用ATAC-
seq和RNA-seq共檢測到結直腸癌細胞系col320
-DM和COLO320-HSR中72049個細胞獲得的轉錄組和染色質開放性圖譜。進一步整合了每個細胞的轉錄組和染色質開放性圖譜，發現MYC的開放性隨RNA表達而增加。MYC在COLO320-DM中的表達與開放性相比于COLO320-HSR是高度異質的。這些結果表明，調控元件可以影響ecDNA在癌基因表達中的細胞間差異。為了鑒定細胞中表達高水平MYC的ecDNA上的活性調控元件，ATAC-seq比較表明，高MYC表達的COLO320-DM細胞既包含更高的ecDNA拷貝數，也包含更多的調控元件，在ecDNA上的差異峰分析鑒定出47個與MYC高表達密切相關的調控元件，而在染色體HSRs上鑒定出5個調控元件，這些結果表明，MYC
轉錄的增加與ecDNA中許多調節元件有關。總之，這些結果表明，細胞間增強子的差異可能是ecDNA 癌基因表達異質性的關鍵。
（3）增強子和啟動子之間的分子間互作促進ecDNA 的異質化和致癌基因的表達
由于發現(i)細胞核內的ecDNA hubs與活躍的癌基因表達相關，(ii)
ecDNA的癌基因表達與差異調節元件相關，作者下一步研究這些差異元件是否參與不同的ecDNA分子之間的增強子-啟動子相互作用。作者整合了WGS、單分子DNA測序和3D
增強子連接體圖譜，分析ecDNA
hubs對致癌基因表達的調控。先根據之前的WGS的數據，檢測COLO320-DM細胞中ecDNA在MYC位點有重排，確定了PVT1能和MYC的外顯子2和3發生融合，并采用nanopore三代單分子測序的方法進行了驗證，結果顯示ecDNA分子在COLO320-DM中存在高度的異質性。隨后采用HiChIP檢測了COLO320-DM和COLO320-HSR中H3K27ac與激活型增強子和ecDNA的作用，發現在ecDNA的拷貝數高的COLO320-DM中H3K27ac與激活型增強子結合越緊密。此外，通過ATAC-seq鑒定了大量的激活型增強子，結果發現其與MYC基因有相互作用。綜上結果，作者認為增強子和啟動子之間的互作促進ecDNA的異質化和致癌基因的表達。
（4）BRD4連接ecDNA hubs并驅動癌基因轉錄
廣泛的遠距離接觸和H3K27ac相關的DNA接觸提高了BET蛋白可能參與ecDNA
hubs轉錄的可能性。BET是染色質閱讀蛋白，為了檢測BET蛋白在ecDNA促進轉錄作用，檢測在兩種細胞中MYC位點BRD4的定位情況。根據H2K27ac，BRD4的ChIP-seq結果和ATAC-seq數據，表明H3K27ac
存在的激活的ecDNA增強子，與BRD4同時存在，BRD4連接ecDNA hubs，促進致癌基因的轉錄。為了評估BET抑制劑JQ1在ecDNA
hubs的功能中作用，作者進行了JQ1處理，發現加入JQ1后ecDNA出現分散，且具有細胞特異性。而加入RNA
PolII抑制劑，降低MYC的轉錄但不影響ecDNA hubs的聚集。通過新生RNA和DNA
FISH和BRD4的ChIP-seq結果表明ecDNA hubs的形成依賴于BET蛋白，而ecDNA
hubs的破壞會引起MYC致癌基因轉錄的抑制和ecDNA癌細胞的死亡。除了BET的抑制劑會抑制ecDNA的轉錄，作者還發現CRISPR的干擾劑，也可以抑制PVT1的啟動子，降低PVT1-MYC的轉錄從而降低總的MYC的RNA水平。這一結果顯示ecDNA可能是調控致癌基因表達的一個更有效的思路。
