膽固醇合成過程比較復雜，有近30步反應，整個過程可根據為3個階段。
1、3-羥3-甲基戊二酰CoA(HMGCoA)的生成
在胞液中，3分子乙酰CoA經硫解酶及HMGCoA合酶催化生成HMGCoA，此過程與酮體生成機制相同。但細胞內定位不同，此過程在胞液中進行，而酮體生成在肝細胞線粒體內進行，因此肝臟細胞中有兩套同功酶分別進行上述反應。
2、甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）的生成
HMGCoA在HMG CoA還原酶（HMGCoA reductase）催化下，消耗兩分子NADPH+H+生成甲羥戊酸(MVA)
此過程是不可逆的，HMG輔酶A還原酶是膽固醇合成的限速酶。
3、膽固醇的生成
MVA先經磷酸化、脫羧、脫羥基、再縮合生成含30C的鯊烯，經內質網環化酶和加氧酶催化生成羊毛脂固醇，后者再經氧化還原等多步反應最后失去了3個C，合成27C的膽固醇。