胰島素受體與[125I]胰島素的交聯實驗
標簽： 胰島素受體 [125I]胰島素 蛋白質純化與鑒定實驗指南 第四單元 實驗 5
本實驗介紹關于胰島素受體與[125I]胰島素的交聯過程。本實驗來源于蛋白質純化與鑒定實驗指南，作者：朱厚礎。
胰島素受體與[125I]胰島素的交聯實驗
實驗方法原理
試劑、試劑盒 純化的鼠肝細胞質膜部分純化的胰島素受體純化的胰島素受體[125I] 胰島素豬胰島素雙琥珀酰亞胺酰辛二酸二甲亞砜NH4Cl甘油SDS-PAGE 樣品緩沖液
儀器、耗材 蛋白質凝膠電泳裝置干膠器
實驗步驟
材料與設備
純化的鼠肝細胞質膜（見本單元實驗 1)
部分純化的胰島素受體，得自 WGA-瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 3)
純化的胰島素受體，得自胰島素瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 4)
[125I] 胰島素（受體級）（DuPont NEN NEX 196)
豬胰島素（17.5umol/L)(如，Sigma Chemical Co.13505)
雙琥珀酰亞胺酰辛二酸（Pierce Chemical Co.21555)
二甲亞砜（DMSO)
NH4Cl(1mol/L)
甘油（10%;v/v)
蛋白質凝膠電泳裝置（BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
干膠器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
試劑
SDS-PAGE 樣品緩沖液（5x)
(配方，見“試劑的配制”，pp.234~240)
操作程序
1）建立如下反應體系:
2) 反應混合物于室溫孵育 2 h。
3) 溶雙琥珀酰亞胺酰辛二酸于 DMSO 中，使終濃度為 10 mmol/L。
4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 雙琥珀酰亞胺酰辛二酸，室溫孵育 1 min。
5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 終止反應。
6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 樣品緩沖液。
7) 樣品煮沸 5 min。
8) 加樣至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。170V 電壓下電泳，至染料前沿跑出凝膠。（關于 SDS-PAGE 的詳細資料，見附錄 5)
9) 將凝膠置 10% 甘油中孵育后，在干膠器上干燥。
注：蛋白質也可轉移至硝酸纖維素膜上，如本單元實驗 6 所述。
10）用放射自顯影法鑒定親和標記的胰島素受體。
結果
交聯實驗的典型結果如圖 4-6 所示。