摘 要:腹瀉性貝毒是一類分布較廣的赤潮毒素,嚴重威脅到人類的健康和安全。本文用膠體金標記利用細胞融合技術制備的抗軟海綿酸單克隆抗體,使用卵清蛋白合成高偶聯比的包被抗原,以硝酸纖維素膜為載體,利用免疫層析技術原理,建立了快速檢測軟海綿酸的免疫層析試紙條方法。方法檢出限12 ng/ mL (0. 96 納克/ 條) 。
關鍵詞:軟海綿酸;單克隆抗體;免疫層析;膠體金
中圖分類號:O658. 1+ 1 文獻標識碼:A 文章編號:100626144(2010) 0120031204
近年有毒赤潮頻發,對我國海洋生態和漁業資源造成了巨大損害,赤潮毒素對海水養殖業及人體健康構成了嚴重威脅。腹瀉性貝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning ,DSP) 是由有毒赤潮藻類鰭藻屬( Di2nop hysis) 和原甲藻屬( Prorocent rum) 產生的一類脂溶性多環醚類天然化合物,主要成分是軟海綿酸(Okadaic Acid ,OA) 及其衍生物,能引起食用者腹瀉、惡心等。腹瀉性貝毒能激發磷酸化來控制大腸細胞內鈉的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A 和PP2A 的強烈抑制劑,也是一種很強的促癌劑,能引起消化道腫瘤的發生[ 1 ] 。我國海產品特別是貝類受腹瀉性貝毒沾污越來越嚴重[223 ] 。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法以及一些免疫化學方法。小鼠生物法簡便易行,適合于大規模、批量樣品的檢測,但不能區別毒素的種類和結構,干擾大、不精確。高效液相色譜法( HPLC) ,特別是液2質聯用技術,可準確分析毒素的含量和種類,檢出限可低至ng/ g ,但樣品前處理繁瑣費時,且儀器昂貴[ 4 ] 。
因此,建立快速、靈敏的赤潮毒素檢測方法,有利于開展大規模水產養殖區和生物樣品監測計劃,對推動貝類毒素研究和保障人體健康十分重要。
免疫化學方法是基于抗體對抗原的特異性結合的一種分析方法,具有靈敏度高,特異性強,器設備簡單,方法易掌握,樣品前處理相對簡單等優點,適于現場監測和大量樣本快速篩查,因而,近年在分析化學領域受到極大的重視且發展迅速[526 ] 。現已有售德國、日本等公司生產的EL ISA 檢測DSP 的試劑盒。
國內已有關于OA 抗體制備和EL ISA 檢測方法的報道[729 ] ,有關腹瀉性貝毒膠體金檢測方法的研究也有報道[ 10 ] 。國內尚未見應用免疫層析技術用于分析DSP 的報道。本文用膠體金標記抗體,通過競爭免疫反應,研制快速檢測OA 的免疫層析試紙條技術,為我國腹瀉性貝毒監測提供快速分析方法。
1 實驗部分
1. 1 主要儀器、試劑與材料
BIODOT 切割機,XYZ23000 噴點儀購自Biodot公司;JASCO V2550 紫外/ 可見分光光度計;恒溫干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、試紙條模具均為國產。
膠體金檢測用樣本墊(玻璃纖維素膜,10 ×300 mm) 、膠金墊(玻璃纖維素膜,8 ×300 mm) 吸水紙(14×300 mm) 均購自Millipore 公司;硝酸纖維素膜(NC 膜,25 ×300 mm) 購自Sartorius 公司。40 nm 膠體金,用1 %檸檬酸三鈉水溶液燒制還原0. 01 %氯金酸水溶液,批量制備紫紅色的膠體金溶液,最大吸收波長538 nm ,其它試劑均為分析純。
1. 3 實驗方法
1. 3. 1 抗軟海綿酸單克隆抗體及包被抗原的制備 本室自制OA2OVA 偶聯抗原(4. 65 mg/ mL) 和抗OA2KL H 單克隆抗體腹水,制備方法和性質鑒定見參考文獻[9 ] 。
1. 3. 2 單克隆抗體腹水的純化 用辛酸硫酸胺方法純化得到粗抗體,再用0. 01 mmol/ L 的磷酸鹽緩沖液( PBS ,p H = 7. 4) 透析4～5 d。用分光光度計測得抗體蛋白濃度為1. 78 mg/ mL 。
1. 3. 3 包被抗原濃度篩選 OA2OVA 偶聯抗原用PBS 稀釋,稀釋倍數分別為原液、稀釋2 倍、稀釋4 倍,稀釋后點在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 備用。
抗原噴NC 膜:抗原用PBS 稀釋4 倍后用XYZ23000 噴點儀噴NC 膜,噴量為:0. 74 μL/ cm , Y = 16cm ,37 ℃干燥過夜,備用。
1. 3. 4 金標抗體的制備 抗體標記量為20μg/ mL 。先取20 mL 40 nm 的膠體金于干凈的燒杯中,用1 mmol/ L的NaOH調節其p H 值為8. 2 ,加入抗體,使其在膠體金中濃度為20μg/ mL ,攪拌1 h ,加入膠體金1/ 10 體積的10 %牛血清白蛋白溶液,攪拌30 min ,5 000 r/ min 離心30 min ,取沉淀,用PBS 復溶,約加入4 mL 緩沖液,用紫外分光光度計掃描膠體金特征吸收峰,確定膠體金OD 值后用PBS 緩沖液稀釋,使其OD 值為5 ,分成100μL/ 管,插入點好各種抗原濃度的NC 膜,觀察NC 膜顯色情況,確定用稀釋4 倍的抗原篩選抗體標記濃度。
抗體標記量的選擇:按照金標抗體的制備方法,標記不同濃度的抗體量,分別為20 、15 、10 、5μg/ mL ,配制適當濃度,使其OD 值為5 ,用XYZ23000 噴點儀將金標抗體噴在膠金墊上,噴金量分別為10 、8 、6 、4μL/ cm ,真空干燥2 h ,備用,抗體共計16 個梯度條件。