1. 3. 5 貝類樣品處理方法 貝類樣品的測定:取新鮮的扇貝,去殼,勻漿,取少許勻漿,加入OA 標準品,使其含量為20μg/ 100 g ,取加標勻漿,用4 倍體積(m∶V = 1∶4) 的80 %甲醇2水超聲萃取5 min ,離心,上清液用PBS 稀釋3 倍,在96 孔加樣板上,加80μL/ 孔,另加80μL/ 孔PBS 為對照。
2 結果與討論
2. 1 檢測原理和條件
腹瀉性貝毒免疫層析快速檢測技術應用了競爭抑制免疫層析的原理,樣本中軟海綿酸OA 在流動過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結合,抑制了抗體和NC 膜檢測線上OA2OVA 偶聯抗原的結合。
如果樣本中OA 含量大于12 ng/ mL ,檢測線不顯顏色,結果為陽性;反之,檢測線顯紅色,結果為陰性。16 個抗體條件的金墊,分別和稀釋4 倍的NC 膜組裝成試紙條,用PBS 檢驗顯色程度。結果顯色均很深。降低抗體標記量,用稀釋4 倍的NC 膜檢測和調節抗體標記量,經過細微摸索抗原濃度,最后確定用PBS 稀釋8 倍的檢測抗原制備NC 膜,0. 74μL/ cm。
降低標記量為5、4、3、2μg/ mL , 調制OD 值為4、5、6 , 噴金量為2、2. 5、3、3. 5、4、6、8μL/ cm ,共84 個金標抗體條件和稀釋8 倍的包被抗原NC 膜組裝,分別用空白(0. 01 mmol/ L PBS) 、PBS 稀釋的軟海綿酸OA 標準品20、15、12、10 ng/ mL 檢測顯色程度和陽
性抑制濃度。加樣量為80μL/ 孔,判斷時間為15 min。最終選擇標記量為:2μg/ mL ,OD 為5 ,噴3μL/ cm ,組裝雙金墊,NC 膜為原液稀釋8 倍的抗原條件組裝成試紙條,檢出限為12 ng/ mL 。
重復性實驗:按照上述實驗條件,重新標記抗體并噴抗原,組裝條件一致的試紙條,檢測結果和原條件實驗一致(圖1) ,空白液顯色一般(0 號卡) ,陽性12 ng/ mL 完全抑制無條帶出現(8號卡) 。
貝類DSP 毒素提取需要80 %的甲醇2水溶液,有機溶劑會干擾抗原抗體反應,因此在PBS 緩沖液中添加不同濃度甲醇實驗,結果表明:檢測樣本中含30 %以下甲醇對免疫學反應無影響。小鼠法陰性樣品驗證了此結果(圖2) 。小鼠法陽性樣品有部分抑制,條帶顏色比空白淺(圖3) 。
對于加標貝樣萃取液的測定結果表明,15 min 內空白對照顯紅色條帶,而貝樣的萃取液(含OA 16. 7ng/ mL) 無顏色條帶出現。當貝類勻漿用5 倍體積的80 %甲醇2水萃取時(含OA 13. 3 ng/ mL) ,實驗結果在15 min 內無顏色條帶出現,但放置長時間(大于2 h) 后,會出現極淺的條帶印跡。因此對于OA 含量稍高于或接近于檢出限12 ng/ mL 的樣品,一定要嚴格控制檢測時間,在15 min 內,與空白對照,得出結果,當時間過長,可能會由于極少量的金標抗體抗原復合物的長時間附著積累,以及其他一些非特異性吸附反應等的作用,而干擾試驗結果的判斷。
2. 2 檢出限與食品安全閾值
一些國家規定的貝類組織中腹瀉性貝毒安全閾值是20μg OA 等價物/ 100 g 貝肉,我國《有毒赤潮監測嶄行規范》推薦20μg OA 等價物/ 100 g 貝肉的限定值。
應用研制的靈敏專一的抗軟海綿酸單克隆抗體,研究建立的貝類腹瀉性貝毒主要成份軟海酸的免疫快速檢測卡(檢出限12 ng/ mL ,時間15 min) ,不需要任何儀器設備,完全滿足該規定閾值,應用于貝類樣品中軟海綿酸的檢測。
2. 3 免疫層析檢測與酶聯免疫檢測方法的比較
免疫層析與酶聯免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗體的特異性結合反應而建立的免疫檢測技術。使用同一種抗體建立的酶聯免疫檢測方法比免疫層析檢測方法靈敏度高,但分析步驟多,反應時間長(2. 5 h) ,定量檢測需使用酶標儀完成;而免疫層析快速檢測方法雖然靈敏度低,但只使用一種試劑,一步操作,可在室溫長期保存,具有簡單、快速、準確、無污染、不需任何檢測儀器的優點,特別適用于現場監測篩選陽性樣品,然后使用色譜等儀器方法驗證鑒定。對于半定量的快速現場篩選具有其他方法不可比擬的優點。
2. 4 建立免疫層析快速檢測技術的關鍵因素
本研究組曾制備抗OA2BSA 單克隆抗體,由于特異性不高,最大抑制率只有30 % ,建立的免疫層析檢測方法靈敏度低,不具有可用于實際樣品檢測的使用價值[11 ] ;而本研究中使用的抗OA2KL H 單克隆抗體,特異性高,最大抑制率可達到90 %以上,因此使用其建立的免疫層析檢測方法靈敏度高,能夠滿足實際樣品安全規定值的檢測需要,建立的分析方法具有實用價值。
結合率高的包被抗原。因為OA 是小分子,不能直接吸附到硝酸纖維膜上,必需偶聯到大分子蛋白載體上。偶聯的分子比是影響檢測方法成功的關鍵因素之一。噴點在檢測線上的包被抗原 OA2OVA ,必需具有較高的OA 結合比,才能夠使得競爭結合的金標記抗體的量能夠產生肉眼可識別的顏色變化,而達到檢測的目的。
建立一種物質的膠體金免疫層析快速檢測方法的影響因素非常多。盡管在理論上已經很成熟,可實際中成功率并不高,尤其對于小分子的間接競爭方法,困難更多。這是一個復雜的實驗過程,涉及到眾多的條件因素。除了上述因素外,膠體金顆粒粒徑的大小范圍,以及顆粒的均一性、都會影響檢測的靈敏度;硝酸纖維素膜的質量,特別是其孔徑的大小和均勻度,會影響可供抗體蛋白質結合的表面積以及樣本通過的毛細流速,從而影響靈敏度;吸水紙等材料的性能,金標抗體的濃度、用量,所加的各種穩定劑、調節劑的種類和量,保存條件等都會嚴重影響測試結果。所以,必須經過大量的實驗工作摸索,嚴格操作,才能保證試紙條的批間差異小于要求值。