膠原纖維的膠原蛋白的染色

膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色，除此之外，它還可以用一些陰離子的染料來進行染色，如用淡綠可把它們染為綠色，用甲苯胺藍可將其染為藍色，在網狀纖維染色中，如不加以處理，它又可被染為棕黃色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫細胞化學染色中，膠原纖維由于含的負電荷過多，常導致某些非特異性的染色，應特別注意。
（一）.Van Gieson（V.G）染色法
I. 試劑的配制：
weigert氏蘇木素
A液： 蘇木素 1g （haematoxylin）
無水酒精 100ml
B液： 30%三氯化鐵 4ml （ferric chloride）
蒸餾水 95ml
鹽酸 1ml
II．Van Gieson氏液
A液： 酸性品紅 1g（acid fuchsin）
蒸餾水　 100ml
B液： 苦味酸飽和水溶液，（1.22%）（picric acid）
注意事項：
1、Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合，幾個小時內用完，最長不得超過一天。
2、蘇木素配后經二十多天才能成熟，必須提前配制。
3、該液能抵抗弱酸性染液，對已著染的細胞核在酸性染液的作用，不易被脫去顏色，如果不特別深染，則無須分化。
4、Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。
操作方法：（后面的各種方法，如沒特別說明，都在室溫下進行）
1、切片脫蠟至水，
2、用Weigert氏蘇木素染20min，
3、水洗，必要時可分化，
4、流水沖洗10min，
5、染Van Gieson氏液1min，
6、用95%酒精快速分化，
7、無水酒精脫水，二甲苯透明，封固。
結果：
膠原纖維：鮮紅色，肌纖維： 黃色，紅細胞： 黃色，細胞核： 藍黑或灰色。
注意事項：
1、該法染完的切片，較易褪色如需照相，應盡早完成。
2、蘇木素染液如為棕色或沉淀，應將其拋棄。
3、分化用的酒精，應使用95%以上的酒精，低濃度的酒精褪色能力強，容易將著染的紅色脫去。
4、切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素，染核效果基本一樣。
（二）.Masson氏三色染色法：天青石藍液的配制：天青石藍（Celestin blue B） 1.25g　硫酸鐵銨（ferric ammonium sulfate）1.25g
蒸餾水 200ml
甘油（glycerin） 30ml
將前兩者溶于蒸餾水中，然后煮沸，冷卻后過濾，再加入甘油和麝香草酚。
Mayer氏蘇木素的配制蘇木素 0.1g　蒸餾水 100ml
鉀明礬（Potassium alum） 5g
檸檬酸（Citric acid） 0.1g
水合氯醛（Chloral hydrate）20mg
配制法：
將蘇木素放入蒸餾水中，用玻棒不停地攪拌直至完全溶解，再依次加入鉀明礬，檸檬酸和水合氯醛，再繼續攪拌，最后加入碘酸鈉，攪拌均勻，即可使用。
麗春紅酸性品紅液的配制：　麗春紅（ponceau 2R） 0.7g
酸性品紅（acid fuchsin）0.3g
冰醋酸 1ml
蒸餾水 99ml
操作方法：　1
、切片脫蠟至水，　2、1%高錳酸鉀氧化切片5min，
3、水洗，草酸漂白1min，
4、水洗，蒸餾水洗，天青石藍染5min水洗，
5、摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏蘇木素3-5min，
6、流水沖洗5-10min，
7、麗春紅苦味酸飽和液染5min，
8、1%醋酸水溶液洗，
9、1%磷鉬酸分化切片約5min，
10、蒸餾水洗，
11、1%淡綠或者甲苯胺藍滴染30s，
12、1%醋酸水溶液洗切片，
13、95%酒精分化，無水酒精脫水，
14、二甲苯透明，中性樹膠封固。
結果：　膠原纖維呈現綠色或藍色，細胞核呈現灰黑或灰藍色，肌肉和胞質紅細胞呈現紅色。
注意事項：①Masson氏染液配完后保存時間不宜過長，如有可能，每次染色以染配為佳，如何可使著色顏色的鮮艷性。②切片在各級酒精中脫水，時間不宜過長，否則會將著染的顏色脫去。③切片保存所著染的顏色顯長為1—2年以后會隨著時間的延長而逐漸褪去，應予注意。④磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同，磷鉬酸作用于膠原纖維，磷鎢酸作用于纖維膠]質，肌膠質，神經膠質和上皮纖維等。上述兩種試劑的使用，可以促進組織有選擇的染色，它們可以減少背景和核的染色，使背景清晰。⑤　如有可能，在組織固定時，用Zenker氏固定液固定，如此對染色效果將更好。
臨床應用：　1
、與淀粉樣物的區別： 膠原纖維發生病變如壞死或透明變性時，它與淀粉樣物在HE染色時被染為粉紅色，不好區別。應用V.G染色法，能將膠原纖維染為粉紅色，而淀粉樣物將被染為黃色。　2、應用與間胚葉來源腫瘤的區別：
如纖維瘤（肉瘤），平滑肌、橫紋肌瘤（肉瘤），神經纖維瘤（肉瘤）、惡性纖維組織細胞瘤等，由于都含有大量的纖維，HE染色均為紅色。應用Masson氏染色法，可將膠原纖維染色藍色或綠色，肌源性組織被染為紅色。
3、應用與其他慢性炎癥的區別。
如慢性闌尾炎，疤痕愈合時，纖維愈復病灶可被染為鮮紅色或藍綠色，SARS病患者愈合后有的肺部可出現疤痕，粘連，此時可顯示藍色或綠色。
可用于鑒定肝硬化及創傷組織的修復程度。肝硬化時的肝組織有許多不同大小的假小葉，用上述方法顯示時，可顯示出不同的組織結構。V.G法可將包繞假小葉的膠原纖維染成紅色，膽汗呈綠色。
小結
膠原纖維在上述的兩種方法中著染不同的顏色，如V.G著染紅色，Masson氏著染藍色或綠色。這主要取決于染料對組織的滲透、吸附、沉淀和反應，而染料分子量的大小是關鍵，分子量小的分子移動迅速，行動快，對組織的滲透性較強，能穿透較為致密的組織。分子量大的染料分子移動較遲緩，滲透力較弱，可作用于組織強求構較疏松的組織，染色時間可適當延長。
在相關的染料中，分子量從小到大依次排列是：苦味酸（黃色）：229.11；桔黃G（黃色）：452；麗春紅（紅色）：480.42；酸性品紅（紅色）：585.53；苯胺藍（藍色）：737.72；亮綠（綠色）：792.72；甲基藍（藍色）>99。
染色是一個較為復雜的化學反應和物理作用的雙重過程，在應用這些方法時，根據不同情況，選擇不同的方法，認真地操作，方能獲得最佳的效果。