動物細胞培養是細胞工程中的重要組成部分,廣泛用于單克隆抗體、疫苗、重組蛋白等生物藥物的生產,具有廣闊的發展前景和市場潛力。開發適合動物細胞培養的載體及其相應反應器,是目前動物細胞培養工程中的重要內容之一。
膠原蛋白是一種天然蛋白,具有良好的生物相容性和理化穩定性,在醫藥、食品等領域中有著廣泛的應用。本實驗以天然膠原蛋白為原料,采用鉻、甲醛、戊二醛改性試劑以及鉻-戊二醛、鋁-植物單寧復合改性試劑對其進行化學改性處理,繼之以濕熱滅菌處理改善膠原蛋白理化性質,特別是膠原蛋白的收縮溫度和膜通透性, 制備動物細胞培養載體。然后,在不同載體上培養 CHO 細胞,通過載體的貼壁實驗、細胞葡萄糖代謝速率以及目的蛋白——促紅細胞生長素(Erythropoietin, EPO)濃度對不同培養載體的生物相容性進行評價;對培養過程中細胞代謝的主要參數——葡萄糖代謝速率以及 EPO 濃度進行監測,通過這兩個參數的變化對細胞的生長周期及培養周期進行預測。
總結上述實驗結果,并進行分析可得出如下結論:
戊二醛改性膠原蛋白經熱處理以后基本保持了原有性質,同時表面性狀得到改善,更重要的是再經過濕熱滅菌處理,其性狀保持穩定,不發生變化,其上述性質使其可以用于動物細胞培養載體的制備。
2. 戊二醛改性膠原蛋白膜的通透性最好,對 BSA 為 2.47 mg·cm-2·h-1,對溶菌酶為 7.26 mg·cm-2·h-1,遠高于天然膠原蛋白膜及其他改性劑改性膜對兩種蛋白的通透性。
3. CHO 細胞在膠原蛋白載體上進行貼壁,3 小時內完成貼壁過程,之后延長貼壁培養時間對貼壁效果沒有更大的影響,說明細胞在膠原蛋白載體上的貼壁比較牢固,不易從載體上脫落。
4. CHO 細胞在膠原蛋白膜載體上培養時,葡萄糖的代謝速率最高時達到 14.2mmol?ml-1?h-1,培養 10 天后 EPO 濃度達到 282 U/ml,相對于 C-DISK 培養細胞葡萄糖的消耗速率提高 16%,EPO 表達量提高近 30 %;相對于 A-DISK 葡萄糖的消耗速率提高了 13%,EPO 表達量提高近 18 %。
5. CHO 細胞培養過程中,不同的葡萄糖代謝速率,反映細胞的代謝水平和目 I的蛋白的表達強度,但這種反映并不是同步的,蛋白的代謝周期要比葡萄糖的代謝周期滯后 1-2 天,因此在細胞培養過程中,可以用葡萄糖的代謝速度對培養過程進行監控和預測, 對細胞的生長和目的蛋白的生產進行調控。
6. 膠原蛋白膜載體成本約 2.0 RMB/g, 僅為進口 A-DISK 載體價格的 5 %;自制 C-DISK 載體成本約 0.2 RMB/g,僅為進口 A-DISK 載體價格的 0.5 %。綜合改性膠原蛋白膜載體在細胞生長及目的產物表達方面的優勢,確定新型膠原蛋白膜載體性價比優于 C-DISK 及進口 A-DISK 載體。