胸腺嘧啶水解酶底物特異性的分子基礎和催化機制

　　10月1日，國際學術期刊Nucleic Acids Research 在線發表了中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所國家蛋白質科學中心（上海）丁建平研究組的最新研究成果：Molecular basis for the substrate specificity and catalytic mechanism of thymine-7-hydroxylase in fungi，該研究工作揭示了真菌胸腺嘧啶水解酶T7H底物特異性的分子基礎和催化機制。

　　DNA胞嘧啶的甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，在很多生物學過程中發揮重要作用，屬于雙加氧酶家族的TET蛋白參與了DNA的主動去甲基化過程。哺乳動物中TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5mC）到5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）的多步氧化反應，該催化過程與真菌中胸腺嘧啶水解酶T7H催化的從胸腺嘧啶（T或5mU）到5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）、5-醛基尿嘧啶（5fU）和5-羧基尿嘧啶（5caU）的多步氧化反應過程在化學特性上存在很多相似之處，且TET和T7H均為雙加氧酶超家族成員。雖然TET蛋白與包含5mC修飾堿基的DNA復合物的晶體結構已經被報道，但TET蛋白識別和區分胞嘧啶C5位不同修飾基團以及催化5mC發生連續氧化反應的分子機制仍不清楚。因此，研究T7H的底物特異性識別和催化機制可以增進對TET蛋白結構和功能的理解。

　　丁建平研究組的博士研究生李文婧等人解析了真菌Neurospora crassa來源的胸腺嘧啶水解酶T7H的原酶形式、輔因子a-KG結合形式以及不同底物結合形式（結合a-KG和T、5hmU或5fU）的高分辨率的晶體結構。結構和生化分析結果表明，T7H只能在輔因子存在的情況下結合底物，且不同底物的結合不會導致活性位點發生顯著構象變化。活性位點的氨基酸殘基Phe292、Tyr217和Arg190在底物結合、催化反應過程中發揮重要作用。T7H與不同底物之間略有差異的親和力和催化活性受到底物C5位修飾基團與輔因子和蛋白之間相互作用的影響。催化反應結束后，產物被首先釋放，然后新的輔因子和底物結合到T7H的活性位點開始新的氧化反應。此外，T7H與TET蛋白的結構比較闡明了T7H催化游離堿基而非DNA中修飾堿基的結構基礎。這些研究成果揭示了T7H底物特異性的分子基礎和催化機制，并為TET蛋白底物特異性的分子基礎和催化機制提供了新的見解。

　　上海同步輻射光源17U線站和國家蛋白質科學研究設施（上海）19U線站在實驗數據收集中提供了支持與幫助。該項研究工作得到了國家科技部、國家自然科學基金委和中國科學院的經費支持。