脂蛋白（a）[Lp(a)] 是心血管疾病危險的重要預示因子。許多研究說明，血漿Lp(a)水平的升高與心血管疾病危險增加有關。對12個預期研究的meta分析，將1617例冠心病（CHD）與10035例對照組的Lp(a)濃度轉換為相同計量單位后，認為：Lp(a)為CHD的獨立預期危險因子；當LDL-膽固醇也增高時，對95％的白種人的男女具有相似的影響；但是，它與無突出的一期或二期高脂血癥的冠狀動脈疾病的進展無關。另外，無論國內或國外，各個實驗室間的Lp(a)檢測結果缺少可比性，一個患者標本的Lp(a)結果，使用不同的試劑或檢測系統，可以出現相差數倍的差異，限制了它在臨床中的廣泛應用。為此，國際臨床化學與檢驗醫學學會（IFCC），于1995年成立Lp(a)工作組，與國際研究機構、多個診斷公司一起，為建立Lp(a)國際參考物質進行探索。歷經8年努力，終于在2004年，IFCC 的生物標準化專家委員會接受了“IFCC SRM 2B”為國際上第一個Lp(a)免疫測定的WHO/IFCC國際參考試劑。該參考物質的每個安瓿內的Lp(a)為0.1071nmol，可溯源至Lp(a)的協同參考方法；將使診斷公司的校準品在計量上溯源性符合歐洲共同體的體外診斷醫學產品通則。本文將對Lp(a)標準化的有關內容作介紹。
一．Lp(a)結構的特殊性是使檢測結果不一的重要原因
為說明這項標準化工作的特殊意義，應當首先了解Lp(a)結構。圖1為Lp(a)的結構。
在結構上，Lp(a)內的核心含有豐富的脂類，周圍具有富含碳水化合物的高度親水蛋白，稱為載脂蛋白（a）[apo(a)]外，還有載脂蛋白B-100（見圖1左側）。Lp(a)顆粒含有的apo(a)和apo B呈1:1的摩爾比率。在Lp(a)顆粒內，apo(a)和apoB-100間以一個二硫鍵互相共價結合。
經研究了解，發現Lp(a)的特殊性質。它的大小和密度呈非均相性，完全因為是apo(a)的獨特性。apo(a)是富含碳水化合物的蛋白，在個體內或個體間的顆粒大小變異大。從內在結構上，發現apo(a)和絲氨酸蛋白水解酶原的纖溶酶原有著高度的均相性。纖溶酶原含有蛋白水解酶區域（domain），每5個domain的復制物稱為環餅結構[kringle]，這樣的環餅結構依次從環餅1到環餅5。每個環餅結構是高度保守的、具有三環（loop）的多肽結構，籍三個二硫鍵予以穩定，這樣的結構也發現于其他在出凝血和纖維蛋白溶解中的蛋白。三環結構在形態上相似于丹麥的餡餅－環餅（kringle），由此命名為環餅。
apo(a)的基本結構可參見圖2。apo(a)含有一個環餅區域（kringle domain）和一個羧基端的蛋白水解酶區域，后者被證實了約有85％的氨基酸組成和纖溶酶原的蛋白水解酶區域相似。除了在apo(a)和纖溶酶原蛋白水解酶區域間具有高度的順序重疊外，由于在這個區域內關鍵氨基酸被取代，和apo(a)結合的部分沒有蛋白水解的活力。環餅結構區域由11段可區分的環餅類型組成，其中10段很相似，但是相互間不一致；后面為纖溶酶原環餅K5結構，該K5區域和纖溶酶原的K5結構具有超過85％的氨基酸是一致的。這10個似纖溶酶原環餅K4區域作為環餅4（K4）的第1段到第10段是一樣的，它們的順序和纖溶酶原K4的一致性達到78％～88％。Apo(a)K4第1段和第3段、一直到第10段似乎在每個apo(a)分子中都只是一個環餅（copy），而K4的第2段存在著多個重復結構、數量上最少為3個，最多可達40個。K4第2段重復的數量不一對apo(a)以及最終的Lp(a)的大小非均相性是關鍵問題，形成了不同的apo(a)的異構體（isoform）。最后一個為K5段，它和纖溶酶原的K5高度相似，最后為絲氨酸蛋白水解酶。apo(a)和纖溶酶原在結構上相似。所以apo(a)被認為是纖溶酶原基因家族的一部分，該家族還包括出凝血和纖維蛋白溶解關聯的其他蛋白。纖溶酶原也含有5個環餅區域（kringle domain），各稱為K1、K2、K3、K4和K5。后面還有一個絲氨酸蛋白水解酶區域（見圖3上半部）。
apo(a)和纖溶酶原相比，沒有纖溶酶原前面的K1、K2和K3環餅區域。所以在解釋apo(a)結構時，一開始就將所有多變的環餅區域稱為K4區域。該區域有多個相似或相同的環餅結構組合起來，替代了纖溶酶原的K4部分結構。后面為一個和纖溶酶原K5高度相似的K5區域；最后為絲氨酸蛋白水解酶（見圖3下半部）。
綜上所述，Lp(a)的多態性的根本問題是內含的apo(a)的多態性，特別是環餅區域K4的第2段中的相似環餅從3～40個不等。不論種族、性別、年齡、是否具有血脂代謝問題等，各個個體內的Lp(a)內、或各個個體間的Lp(a)間，apo(a)的多變是檢測結果變異的主要原因。apo(a)的大小從187 kDa到662 kDa。大小的不均一影響了血漿中Lp(a)免疫化學檢測水平。在免疫檢測中，抗體若是抗重復的K4第2段抗原，apo(a)顆粒小于存在于檢測校準品內apo(a)的，Lp(a)結果偏低；反之，結果偏高。只有使用可識別每個apo(a)上僅一個類型環餅結構蛋白片斷的、或抗apoB-100（apoB）的、或Lp(a)其它蛋白組分的抗體，才能準確地檢測Lp(a)。另外，使用mg/L的質量單位表示Lp(a)是不準確的，因為在各個Lp(a)顆粒中，apo(a)與apoB的質量比率各異。所以，應以nmol/L表示Lp(a)蛋白含量。
二．選擇參與Lp(a)標準化工作的檢測系統
1．確認一致同意的Lp(a)參考方法
為了準確檢測所有血漿樣品中的Lp(a)，與apo(a)顆粒多態性無關，在美國西雅圖的華盛頓大學西北脂類研究實驗室，使用抗apo(a)的K4 type9的表面決定簇的單克隆抗體，形成了直接結合的雙單克隆抗體酶聯免疫測定方法（a-40 ELISA），檢測血漿中的Lp(a)。許多研究工作者對該檢測方法作了詳細的評價，說明apo(a)的不均一不影響測定準確度。使用抗apo(a)K4 type8決定簇的不同檢測抗體，又形成了另一個免疫測定（a1-1 ELISA），也顯示了它對apo(a)異構體大小不均一的不敏感。因為以上任何單克隆抗體都不會與apo(a)分子的多變部分的決定簇反應，可以摩爾（mol）單位表示設定靶值。
2．選擇合適的Lp(a)參考物質
在標準化的第一階段，對8個Lp(a)商品校準品檢測了分析性能，其中一些校準品顯示了在精密度、線性與平行性的測定特性上，與血清樣品具有可比性。對Lp(a)值單位處理后，一些校準品的Lp(a)值在方法間很靠攏，但其它的離散很大。因此，IFCC工作組不采用現有的任何公司校準品為候選的參考物質。
在第二階段，對4個新制備的材料檢測了精密度、線性、互通性以及方法一致性等，使用了27個檢測系統予以檢測（表1）。
注：IHSP（in-house serum pool，自制混合血清）；FSCC（frozen serum control C，冰凍血清控制品C）。
注1：是對于IHSP最優化的檢測系統（即在對人血清檢測屬最佳的系統）；
注2：精密度為檢測系統內CV的中位數。這是對50%與100％的PRM進行Lp(a)重復檢測的結果；
注3：線性評估：對PRM從20％～100％，互相間隔10％的Lp(a)線性實驗；判斷：線性回歸的斜率為0.9～1.1，截距在－10％～＋10％間，為線性。
注4：平行性：對9個同一個稀釋度的PRM、FSCC與IHSP進行Lp(a)檢測，用單向的ANOVA比較它們的回歸斜率；若可能性p＞0.01，認為具有平行性。
注5：評估檢測系統的協同性：對系統間校準差異作Lp(a)濃度糾正后，系統間檢測結果差異的CV％。（依據FSC C為標準）。
經比較，SRM 2B使18個INA與ITA檢測系統的變異小于8％（表2），顯示分析性能可接受；以及在穩定性上表現良好。所以選擇SRM 2B為Lp(a)的通用校準品，用于進行一致性檢測調查前，為各個系統的廠商校準品定值。
注：CHOL方法為Lp(a)-膽固醇-測定；DELFIA方法為dissociation－enhanced－ligand 熒光免疫測定；INA為免疫散射比濁測定；ITA為免疫透射比濁測定。在檢測SRM 2B的Lp(a)濃度時，均以FSC C為標準，校準后檢測SRM 2B的100％與50％的質量濃度。然后將正確的質量濃度值轉換為nmol，以a-40 ELISA的Lp(a)結果為準予以換算。
3．確定Lp(a)的一級參考物質
對來自含有19個K4區域的單一apo(a)異構體的供體血清，在兩個獨立實驗室分別進行Lp(a)的分離與純化。一個實驗室使用連續超離心與分子網層析等技術分離；另一個實驗室采用賴氨酸-葡聚糖凝膠過濾和氯化銫分級超離心技術分離純化Lp(a)。二者Lp(a)的化學組成非常相似；每個分離制品作氨基酸重復分析，確定Lp(a)蛋白作摩爾單位的準確絕對質量。成為Lp(a)一級參考物質。
4．對SRM 2B的Lp(a)定值
使用兩個實驗室制備的Lp(a)一級參考物質，為SRM 2B設定靶值。使用對每個新鮮制備的分離Lp(a) 。使用一致統一的兩個ELISA參考方法（使用的單克隆抗體分別為a-40或a1-1）進行定值。兩個參考物質、兩個參考方法組合的四個檢測系統，每一個系統均繪制6點的標準曲線，每點重復4次。共進行4天實驗，每天在各個組合系統的3個板上，各對SRM 2B進行一組雙份測定。同時，在每個板上分析4個控制品，每個控制品進行雙份檢測。在4個連續天內，共得到SRM 2B的144個結果。所有定值結果可參見表3。無論使用哪一個Lp(a)一級參考制品、或無論使用哪一個ELISA參考方法，對SRM 2B的定值非常相似，最后的定值為：107.1nmol/L±8.6 nmol/L。
5．SRM 2B的組成與表現
每個SRM 2B的安瓿內含有混合人血清、穩定劑與防腐劑疊氮鈉（1.08 g/L）的凍干物。復溶的SRM 2B內含有以下的各個脂類在低或正常的水平：膽固醇（3.6 mmol/L），甘油三酯（0.6 mmol/L），LDL-膽固醇（2.3 mmol/L），HDL-膽固醇（1.0 mmol/L）；蛋白為37 g/L。樣品經1：100稀釋后，濁度＜1％光散射單位、或于340 nm處的吸光度為0.0132，可以忽略不計。Lp(a)的異構體由三個主要的apo(a)多形體組成，在凝膠上表現幾乎相等的強度，各含有16、17與18個K4環餅結構。三個最少的多形體分別為14、20與32個K4環餅結構。
經觀察，SRM 2B的Lp(a)含量與電泳表現，6年沒有變化。在這段時間內，使用SDS-瓊脂糖電泳與免疫印跡檢驗，沒有發現apo(a)增加的區帶或凝集產品。復溶后，若緊蓋并保存于2～8℃，可穩定1周。復溶液不能冰凍，若出現沉淀應棄去。
三．Lp(a)標準化工作的第三階段：使用推薦的SRM 2B參考物質后對實現患者血清檢測結果一致性的評估
22個檢測系統以SRM 2B校準后，檢測三個控制品，Lp(a)的濃度在29、104與185 nmol/L，方法間的CV分別為：11.9％、11.5％與9.5％。然后各個檢測系統使用校準值可溯源至SRM 2B的自制校準品，校準系統后再檢測這三個控制品，結果與上述幾乎一樣。另外，在排除一個有問題的系統后，方法間檢測SRM 2B的CV僅2.8％；除了一個系統外，其余系統結果的均值與靶值差異在5 nmol/L內。
以這些結果為基礎，在第三階段由16個廠商與6個研究實驗室對SRM 2B材料評估，確定它是否具有將基礎的準確值傳遞給廠商的校準品的能力；并經該物質標準化后，在各個方法間結果的一致性的能力。選擇了30份健康供體的新鮮冰凍血清，內含Lp(a)值與apo(a)異構體范圍大而廣；具有的K4 apo(a)區域為13～31個、Lp(a)含量范圍為10～414 nmol/L，使用a-40 ELISA Lp(a)參考方法為之定值。各個Lp(a)檢測系統包括：10個免疫透射比濁測定（ITA）、8個免疫散射比濁測定（INA）、2個熒光免疫測定（FIA）、1個免疫電泳測定和1個ELISA。幾乎所有的檢測系統均使用多克隆抗體抗檢測Lp(a)的apo(a)部分，來檢測Lp(a)，有2個ITA方法使用標記于膠乳顆粒的單克隆抗體，1個FIA方法（DELFIA a/B）使用了抗apoB作為檢測抗體的多克隆抗體。
30例樣品的檢測結果CV從6％～31％。樣品濃度在Lp(a)＜25 nmol/L的，CV為19％～31％；Lp（a）在100～414 nmol/L的，CV為6％～17％。每個Lp(a)檢測系統的檢測值與協同的參考檢測系統的定值作比較，評價各系統的準確度。結果說明在30份樣品中apo（a）異構體范圍大，各檢測系統對apo(a)大小的非均一很敏感，對于apo(a)異構體分布廣泛的各個樣品，檢測結果變異明顯大于SRM 2B。Lp(a)的膠乳增強ITA方法是最準確的檢測系統，它們的平均絕對偏倚僅4.4 nmol/L；其它方法的偏倚為12.4～23.8 nmol/L。僅兩個Lp(a)檢測系統對apo(a)異構體的非均一具有最小的偏倚。通過使用SRM 2B，在Lp（a）的膠乳增強ITA方法與Lp(a)的協同參考a1-40 ELISA測定間，具有了極其重疊的Lp(a)結果。很明顯，無論是一級或二級的參考物質，因為apo(a)大小的非均一的影響，都不能消除不同分析方法間得到的Lp(a)值的實質性差異。
四．WHO生物標準專家委員會批準IFCC SRM 2B為“第一個Lp(a)免疫測定國際參考試劑”
WHO生物標準專家委員會在批準IFCC SRM 2B為“第一個Lp(a)免疫測定國際參考試劑”中，不僅要求標準化計劃的實驗設計與實施具有科學性，而且也要求文件完整，報批過程嚴密；為此，所有工作又延長了3年才完成。這些包括：技術報告的編寫、對IFCC SRM 2B長期儲存與監視的數據收集、將參考物質與確認材料分送評估等。初步批準該物質為可行的參考物質的是IFCC科研部門成員，然后是IFCC的執行董事會，是他們于2002年早期將IFCC SRM 2B上交給WHO，要求認可為Lp(a)國際參考試劑。技術報告送給WHO生物標準專家委員會（WHO ECBS），希望在2003年2月的年會前作評論。經初步評估，WHO還要求進一步明確系列技術要點，特別是物質在高溫下、復溶后的穩定性，批間的恒定性，以及分送評估的文件。并要求最終表示為每個安瓿的含量，而不是Lp（a）濃度，還需要Lp(a)定值的不確定度。確保實施ISO導則，實現可追溯性與檢測的不確定度。
最后，WHO在2003年11月，正式接受IFCC SRM 2B為“第一個Lp(a)免疫測定國際參考試劑”，完整的稱呼為：WHO/IFCC SRM 2B。該參考物質儲存于玻璃安瓿，內含0.1071±0.0086 nmol的Lp(a)（依據分裝時的不精密度，變異為2.9％）。它的定值可追溯至Lp(a)的協同參考檢測系統。依據歐共體的體外診斷醫學產品通則（IVDD），要求診斷公司的校準品值在計量上可追溯至較高水平的參考物質。使用WHO/IFCC SRM 2B將符合IVDD的要求。IFCC SRM 2B保存在美國西雅圖的西北脂類研究實驗室，供Lp（a）研究部門與診斷廠商使用。
總之，IFCC的Lp(a)測定標準化工作組的初衷，已經為統一免疫測定Lp(a)結果提供了實在的解決方法。所以，通過IFCC的努力，校準Lp(a)檢測系統的全球性協同已經實現。WHO/IFCC SRM 2B的使用將消除檢測系統間變異的主要因素。通過使用標準化方法可溯源至“第一個WHO/IFCCLp(a)免疫測定國際參考試劑”，如推薦那樣，現在可以作出確定在各種人群中未來心血管疾病危險增加的判斷限。
五．將Lp(a)定值轉移給靶物質的程序
在提供SRM 2B的同時，還有3個冰凍血清，以確認值轉移的成功。
1． 使用復溶的SRM 2B（Lp(a)值107.1 nmol/L），依據您日常的檢測方案校準您的Lp(a)測定。應將SRM 2B配制于磷酸鹽緩沖液，作預先稀釋。
2． 在2天內，進行兩批實驗；每批對3個您的一級校準品分別進行4次檢測。一共得到48個Lp(a)值。
3． 每批應進行校準曲線的繪制。
4． 確定您一級校準品的Lp(a)均值與標準差。
5． 使用一級校準品得到的Lp(a)均值，按照您日常Lp(a)測定程序進行校準。
6． 凍融3個水平的冰凍血清樣品各一支（A0x、B0x、C0x），內含不同大小的apo(a)，在您的Lp(a)測定程序中檢測，以確定值轉移程序的準確度。