實驗方法原理 低熔點瓊脂糖制備規模的 PFGE 經常被用于 DNA 片段的分離。不同大小的 DNA 可以用限制酶酶切產生高分辨率酶切圖譜或產生用于插入噬菌體或質粒載體的片段。
實驗材料 DNA 大小標準基因組 DNA
試劑、試劑盒 溴化乙錠酚：氯仿
儀器、耗材 水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
溴化乙錠 ( 1 μg/ml ) 或適當稀釋度的 SYBR Gold
酚：氯仿（1:1, V/V) ( 可任意選擇的）
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 大小標準
低熔點瓊脂糖栓包埋的基因組 DNA
3. 專用設備
設置 65~68℃ 及瓊脂糖酶消化的適宜溫度的水浴
二、方法
1. 準備制備用低熔點瓊脂糖 PFGE, 它將提供分離目的 DNA 片段的最佳分辨率。
2. 制備槽的兩側加樣孔分別加入 DNA 分子質量標準和單個酶切基因組 DNA 的凝膠栓。將制備樣品加入制備槽。
3. 電泳結束后，切下含有分子質量標準和單個基因組 DNA 栓的泳道，室溫溴化乙錠或 SYBR Gold 染色 30 min。如果需要可以水中脫色 30 min。不要染制備泳道。
4. 紫外照射檢查染色切片，在切片目的 DNA 的側面做上刻痕標記。
5. 重新把染過色的分子質量標準和單個栓的凝膠組合起來，將未染色的制備泳道中的目的 DNA 大致定位。仔細地用干凈剃刀割下這個區域，把凝膠切片轉移到帶蓋聚丙烯管中。長期貯存，片段應置于 4℃ 密封管中。點印跡或 Southern 印跡可以更精確地獲得制備膠中目的片段的定位（van de Pol et al.，1990)。
6. 瓊脂糖酶緩沖液覆蓋凝膠片段，室溫溫育 1 h, 其間偶爾振動。倒去緩沖液，重復操作 2 次。
7. 更換完緩沖液后，65~68℃ 熔化含有 DNA 片段的瓊脂糖切片。熔化時旋轉小管以確保熔化完全。
8. 溶解的膠中加入適當量的瓊脂糖酶。建議在廠家推薦的溫度下消化凝膠。
9. 消化后，加熱使瓊脂糖酶失活或通過酚: 氯仿抽提將酶除去。