脈沖場凝膠電泳的分子質量標準

實驗方法原理 PFGE 用于分離很大的 DNA 分子，因而需要很高分子質量的標準。這種標準可以按照 Lauer 等（1977 ) 介紹的方法從噬菌體，如 T7 (40kb)、T2 (166kb）和 G (758kb) 提取獲得。但是一個更好的覆蓋范圍更廣的系列標準是 λ 噬菌體 DNA 的系列串聯體。后面介紹的具體步驟是 Vdlrath 和 Davis (1987) 方法的改進。

實驗材料 噬菌體 T4 DNA 連接酶純化的噬菌體 λDNA

試劑、試劑盒 ATPDithiothreitolEDTA連接緩沖液低熔點瓊脂糖緩沖液聚乙二醇TE

儀器、耗材 低熔點（LMT ) 瓊脂糖Tygon 管水浴

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

ATP ( 0.1 mol/L)

Dithiothreitol ( 1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

含聚乙二醇的 1X 連接緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH7.6)，1 mmol/L ATP，10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，10 mmol/L MgCl2，2% PEG 8000）

低熔點瓊脂糖緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，20 mmol/L MgCl2）

MgCl2 ( 20 mmol/L)

聚乙二醇（8%, m/V，PEG 8000 溶液）

TE (pH7.6)

2. 酶和緩沖液

噬菌體 T4 DNA 連接酶

3. 凝膠

低熔點（LMT ) 瓊脂糖

4. 核酸和寡核苷酸

純化的噬菌體 λDNA

5. 專用設備

Tygon 管

56℃ 水浴

二、方法

1. 在 10 ml LMT 緩沖液中通過沸水浴或微波加熱溶解 0.1 g 低熔點瓊脂糖。冷卻到 37℃。

2. 在 172.5 μl TE (pH 7.6) 中溶解 10 μg 純化的噬菌體 λDNA, 加熱該溶液至 56℃  5 min。

3. 冷卻溶液到 37℃，迅速按順序加入下述試劑：

8%PEG8000                    62.5 μl

20 mmol/L MgCl2             5.0 μl

0.1 mol/L ATP                  5.0 μl

1 mol/L DTT                     5.0 μl

噬菌體 T4 DNA 連接酶      0.5 Weiss 單位

1% LMT 瓊脂糖溶液         250 μl

聚乙二醇起集聚劑的作用，增加連接效率。

4. 混合物吸入一個稍短的 Tygon 管，在冰上冷卻至瓊脂糖完全凝結。

5. 將凝膠栓移入一個無菌的一次性塑料管內，其中有 3 倍體積的含聚乙二醇的1x 連接緩沖液。

6. 凝膠栓在連接緩沖液內室溫溫育 24 h, 然后轉移到 10 倍體積 20 mmol/L EDTA ( pH 8.0）的試管內。

7. 在 EDTA 中溫育 1 h, 再將凝膠栓轉移到新鮮 10 倍體積 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 的試管內。