脊索瘤相關基因鑒定及篩查實驗，用于（1）脊索瘤分子機制（2）基因診斷（3）基因治療。
| 實驗方法原理 | 真核生物的mRNA 5’端有個帽子結構，3‘端有長約200 bp 的poly(A)尾巴。據此特點，可設計一種與其互補的序列oligo dT，為了把它錨定在poly（A）尾的起始端，將其設計成T12MN（M=A/C/G；N=A/T/C/G），這樣T12MN 就有12 種不同的組合。將T12MN 作為反轉錄引物，就可以將帶有poly（A）尾的mRNA 反轉錄為相應的cDNA，再用該引物錨定cDNA第二鏈的3′端，此時引入一隨機引物進行PCR 擴增，由于隨機引物隨機結合在cDNA 的互補靶位點上，源于不同mRNA的擴增片段其大小不同，因此經過PCR 擴增的產物其大小也不同，通過電泳等技術顯示在凝膠上，就可以檢測到有差異的cDNA片段。經過驗證其確實為特異片段，進而篩選cDNA文庫或運用cDNA 末端的快速擴增（ Rapid Amplification of cDNA End，RACE）技術獲得全長cDNA。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、 材料準備 1. 標本 18例脊索瘤及其周圍正常組織(距腫瘤5 cm以上)標本來自中國醫科大學附屬第一、二醫院、遼寧省人民醫院、沈陽市中心醫院骨科，經病理切片確診為脊索瘤，取材后立即置于液氮中速凍，然后貯存于-7O℃冰箱中備用。本研究中mRNA-DD試 驗所用標本編號為15，采自中國醫科大學附屬第一醫院(2000-10-20)，60歲男性患者， 病理號為328874。 2. 引物 錨定引物(Anchored primer，HIEROGLYPH)： T7(dT12)AP8 5 ACGACTCACTATAGGGCrITITTrrrrrIT丌AA3 T7(dT12)AP11 5 ACGACTCACTATAGGGCTT1Tn T 幾TIrrAT3 隨機引物(Arbitrary primer，HIEROGLYPH)： M13r-ARP1： 5 ACAArITITCACACAGGACGACTCCAAG3 M 3r-ARP2：5 ACAArITITCACACAGGAGCTAGCATGG3 M13r-ARP3：5 ACAArITITCACACAGGAGACCATrGCA3 M13r-ARP4：5 ACAArITITCACACAGGAGATAGCAGAC3 二、 總RNA提取 應用Trizol試劑(GIBCOBRL)提取總RNA。 三、 反轉錄 取1 ug總RNA，應用GIBCOBRL的反轉錄試劑盒進行反轉錄，PCR反應體系20 ul，引物為1_7(dT12)APs，條件見試劑盒。 四、DD-PCR擴增 引物為M13r-ARPs，體系為10 ul，PCR擴增條件為：95℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 2 min，5個循環：95℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，31個循環。 五、產物檢測 取3 ul產物進行8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(50℃ ，3000 V，100 W，4～5 h)，GenomyxLRTM Fluores-cent Imaging Scanner掃描。然后將差異條帶切下。 六、差異cDNA片段的純化、測序、同源性比較與分析
差異條帶重新進行PCR擴增， 擴增條件同DD-PCR，體系10.0 ul。將純化的cDNA片段進行測序(上海生工生物工程技術公司)，測序結果在互聯網上進行同源性比較和分析。 七、 差異cDNA片段的驗證 根據兩個差異cDNA片段的測序結果，分別設計一對特異引物(擴增507 bp和448 bp兩個片段)，以相同脊索瘤患者的總RNA為模板，進行RT-PCR反應。兩對特異引物的復性溫度分別為58℃(cDNA1)和60℃(cDNA2)，引物序列如下： cDNA 1：TCTGCCACATCTrGGCCrITITCAACCTCTGCTFCCCAGGCT cDNA2：AACAGCCCTCAGCATrGGCTATGCCCAGATGGAGCCTCTC 內對照所用B-actin(318 bp)引物序列如下： MW 5，ATCATGrITITGAGACCTCCAACA3 MW 5 CATCTCTFGCTCGAAGTCCA3 PCR反應條件：94℃ 30 s，58℃～60℃ 30 s，72℃1.5 min，35個循環。2%瓊脂糖凝膠電泳， 條件為80 V，60～90 min，自動凝膠電泳成像分析儀分析結果。
八、 差異cDNA片段與脊索瘤相關性的篩查 按照差異cDNA片段的驗證實驗所用方法，對剩余17例脊索瘤及其周圍正常組織進行cDNA1和cDNA2兩個差異片段的RT-PCR篩查。
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| 注意事項 | 第二代是限制性酶切片段差異顯示技術，也就是所謂的RFDD-PCR。限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是對相對應liangpeng發明的傳統ddrtpcr的很有效的改進。RFDD-PCR不是直接擴增cDNA，而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。 |
| 其他 | Sokolov等首次用瓊脂糖凝膠電泳，EB呈色替代聚丙烯酰胺電泳和射自顯影，使得工作大大簡化。崔凱榮等對該方法加以改進，利用DD-PCR成功地得到3個在枸杞體細胞胚發生早期組織中基因特異表達的片段。 |