（2）術前準備
取一根臍帶（離體3個小時內，平均1小時，剪去夾傷部位）
2個50ML注射器，1個30ML注射器和1個10ML注射器
1個止血鉗，2根插管，14號線2CM長，消毒巾，消毒手術刀和無菌手套
手術區域準備：一塊床單和無菌手套封套
3 臍帶手術操作和培養
（1）用手術刀整齊切斷臍帶兩端
（2）靜脈（口徑最大的脈管）兩端各導入一帶有膠管的玻璃導管，用線緊綁（臍帶結）
（3）用50ML的注射器吸入PBS液清洗臍帶
（4）用30ML的注射器把10ML的0.2%膠原蛋白酶從靜脈的一端注入，直到血管充盈為止
（5）當從另一斷漏出時，用止血鉗緊端口
（6）退出注射器，用止血鉗夾緊膠管
（7）把臍帶放在在37℃的盛有臍帶緩沖液中培養15分鐘
（8）其間輕輕的擠壓臍帶
（9）用10ML完全培養液填滿一個50ML的無菌錐形離心管中
（10）用這個錐形離心管收集用40ML的PBS沖洗臍靜脈出來的溶液
（11）在1000轉/分下離心10分鐘
（12）棄上清，再加入20ML的培養液
（13）用30ML帶針頭的注射器分離細胞（反復吹打推出3次）
（14）取0.1ML細胞懸液在血細胞計數板計數。最后調整細胞數，以0.5-1.5×105/ML接種至24孔培養板中，每孔1ML。培養基應該放進濕度為95%，5%CO2和溫度為37℃環境中。接下來的一天，通過更換培養基來把非粘附細胞移除。以后培養基每隔兩天更換一次。換液時吸去原培養液的1/2--2/3，加入新鮮培養液。
三、傳代培養
待細胞生長成單層后，棄培養液，PBS洗兩次。0.01%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，按1：3-1：5傳代
四、血管內皮細胞鑒定
用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內皮細胞， 接種在24孔塑料培養板各孔內4h 后， 大部分細胞貼壁。早期細胞呈小多角、球形、呈團狀， 少數細胞伸展，
48～ 72h 生長最快， 逐漸生長成梭形， 有些細胞排列呈魚貫狀相連， 間有旋禍狀排列。核清晰， 呈圓形或橢圓形， 核分裂相多見， 1～ 2
核仁， 胞漿豐富， 內含小顆粒。于3～ 4 d 后融合， 7～ 10 d 胞體呈多角形，相互嵌合， 為單層呈鋪路石狀排列。
五、注意事項
培養內皮細胞培養基中有兩樣東西很重要，而且不能省：1.用好的胎牛血清 2.生長因子；此外內皮細胞很容易脫落。例如用M199干粉，加入20％小牛血清或10％胎牛血清，2ug/ml生長因子，10－20代用于實驗。
六、VⅢ F相關抗原免疫光法檢測：
操作：培養三天至四個星期內，在24 孔塑料培養板孔內放置無菌的蓋玻片0.5 cm ×0。6 cm ，在蓋玻片上點100μl 濃度為5.0
×105 / ml 的細胞懸液， 在37 ℃，5 %CO2 條件下培養4 h ，使細胞貼壁， 然后加入2ml
培養基繼續培養。待內皮細胞生長至近融合狀態時，用PBS 洗3 次，每次5 min ，然后加入丙酮，室溫下固定10 min ，再用PBS 洗3
次，每次5 min ，干燥后加第一抗體———兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體100μl（1 : 50 倍稀釋），放入濕盒內37 ℃保溫1 h
，同時以磷酸緩沖液替代一抗作陰性對照。用PBS 洗3 次，干燥后加FITC 標記的二抗———羊抗兔IgG ，放入濕盒內37 ℃保溫1 h
，用PBS 洗2 次，再用蒸餾水洗一次，干燥后用50 %緩沖甘油封片。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。
理想結果：原代及傳代培養的內皮細胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個細胞輪廓清楚。作為對照的內皮細胞片子中，偶見綠色斑點散發熒光，未見細胞輪廓。然后用rhTNFα造成細胞損傷及凋亡，并用藥物干預。