脯氨酸含量的測定

實驗概要

脯氨酸（proline，Pro）為α-氨基酸之一。L化合物為明膠、麩蛋白（麥醇溶蛋白）、玉米醇溶蛋白、鯡精蛋白、鮭精蛋白、酪蛋白等多種蛋白的組成成分，特別是明膠中最多（約占20％）。脯氨酸是唯一的醇性氨基酸，易溶于水。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標。另外，由于脯氨酸親水性極強，能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程，因而能降低冰點，有防止細胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標。

實驗原理

磺基水楊酸為白色結晶或結晶性粉末，能溶于乙醚，易溶于水和乙醇，高溫時則分解，若帶有微量鐵離子時為粉紅色結晶體。用磺基水楊酸溶液提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標準曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。

主要試劑

1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中；

2. 3％磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；

3. 冰醋酸；

4. 甲苯。

主要設備

722型分光光度計、研缽、100ml小燒杯、容量瓶、大試管、普通試管、移液管、注射器、水浴鍋、漏斗、漏斗架、濾紙、剪刀。

實驗材料

待測植物（水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。

實驗步驟

1. 標準曲線的繪制

   1）在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標準液中每ml含脯氨酸100μg。

   2）系列脯氨酸濃度的配制取6個50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1，2，3，4，5及6μg/ml。

   3）取6支試管，分別吸取2ml系列標準濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。

   4）冷卻后各試管準確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉至甲苯溶液。

   5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520nm波長處進行比色。

   6）標準曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標準曲線，計算2ml測定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。

2. 樣品的測定

   1）脯氨酸的提取：準確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。

   2）吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。

   3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。

   4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計上520nm波長處比色，求得吸光度值。

3. 結果計算

根據回歸方程計算出（或從標準曲線上查出）2ml測定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后計算樣品中脯氨酸含量的百分數。計算公式如下：

脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/樣重（g）。