首先，dUDP轉換為dUMP，有幾條途徑：一條是在核苷單磷酸激酶催化下，dUDP與ADP反應生成dUMP和ATP；另一條途徑是dUDP先形成dUTP，然后水解生成dUMP和PPi。dCMP經脫氨也可以形成dUMP。然后，dTMP是由dUMP的C-5甲基化而形成的。催化此反應的酶是胸腺嘧啶核苷酸合酶（thymidylate synthase）。
DNA合成的底物為4種dNTP，一磷酸或二磷酸脫氧核苷可由激酶的催化和ATP供能而形成三磷酸脫氧核苷。
