脫落酸（ABA）放射免疫測定

原理

 

ABA放射免疫測定(radioimmunoassay, RIA)是一種分子相同的標記ABA(*Ag)和非標記ABA(Ag)與另一種濃度有限的專一性抗ABA抗體(Ab)進行的競爭性抑制反應：

 

當反應體系中*Ag和Ab量保持恒定，并且*Ag量>Ab量(*Ag: Ab100: 35)時，加入的Ag量越多，則*Ag被稀釋的程度也就越大，使結合的*Ag·*Ab(B)（B為bound，表示結合狀態）量隨之減少，（即Ag·Ab量增加），游離的*Ag（F）（F為free，表示游離狀態）量增多。因此，B/B F或B/T（T為total，即T=B F）或B/F與Ag量存在著一種函數關系。抗原抗體反應平衡后，用飽和硫酸銨溶液分離游離和結合狀態的標記ABA，在液體閃爍器上測定游離標記ABA的放射性。如以一系列已知濃度的ABA對B/T或B/F作圖制成標準曲線，就可根據樣品管的放射性強度從標準曲線上查出未知樣品中的ABA含量。

用ABA—C₁ OOH和牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)的結合物制備的抗ABA抗體，對結合態ABA(^C ABA,C表示羧基)的親和力稍大于游離態ABA(^F ABA)的親和力。植物樣液里的葉綠素和胡蘿卜素等親脂色素是一類干擾液體閃爍計數的有色淬滅物質。對樣液進行萃取分離，可以很方便地將有色淬滅物質除去，將樣液分離為^F ABA液和^C ABA液（回收率94梍96%。從而用本法準確測出樣品的C^ABA 和F^ABA 含量。

 

儀器藥品

 

1．儀器設備

低溫高速離心機 　　　　　普通離心機

渦旋混合器 　　　　　　　微型研缽

尖底離心管 　　　　　　　試管架

微量加液器 　　　　　　　微量進樣器

2．ABA RIA藥盒（南京農業大學產品）

(1)磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS,干粉)，2瓶。每瓶干粉先用5ml熱的蒸餾水溶解，再定容到50ml，即為含有0.1%NaN³ 和0.1%明膠的pH7.4的0.01mol/L的PBS液。4℃貯放備用。

(2)2—cis（ ）³ H—ABA液（干粉），3瓶（0.2μCi/瓶）。每瓶干粉加3.5ml PBS液溶解，每50μl含有7000─9000cpm（計數率62%）。避光，－20℃保存備用。

(3)2─cis（ ）ABA標準液（干粉），5瓶。每瓶加1ml PBS液溶解，每50μl分別含有300、600、1200、2400、4800pg ABA。避光，－20℃保存備用。

(4)兔抗2─cis（±）ABA抗體（干粉），1瓶。用19ml PBS溶解，分裝3─4個小瓶，置－20℃保存備用。

(5)0.5%BSA溫育液，1瓶。用10ml PBS溶解BSA干粉，4℃保存備用。

(6)飽和硫酸銨分離液（saturated ammonium sulfate, SAS），1瓶。在50ml熱蒸餾水中深入硫酸銨，4℃保存，待粗大晶塊出現后使用。

3．自備藥品

(1)閃爍液：取萘60g,1,4－雙[2′（5′－苯基噁唑）]苯（POP—OP）40mg，2，5二苯基噁唑（PPO）4g，溶入1000ml二氧六環中，避光保存備用。

(2)0.01mol/L H₃ PO₄ 液，pH2.5。

(3)0.01mol/L Na₂ HPO₄ 液，Ph9.2。

(4)80%甲醇。

(5)乙酸乙酯。

(6)無水酒精。

 

操作步驟

 

1．提取樣液

準確稱取50─100mg鮮重的植物試樣，立即置于在冰浴中預冷的研缽中，加1ml80%甲醇（4℃）和少許石英砂，在弱光下仔細研磨成勻漿。將上清液收入離心管，殘渣再用同法重復研磨提取2次，合并提取液，3000g（4℃）離心10分鐘，吸出上清液，貯－20℃備用。

2．樣液中^c ABA和^F ABA及有色淬滅物質的萃取分離

(1)^c ABA、^F ABA及有色淬滅物質的分離：取100μl樣液置萃取用尖底試管（A管）中，氮氣吹干，隨即加入100μl pH2.5的0.01mol/L的磷酸液洗脫，渦旋混合2分鐘，再加入100μl乙酸乙酯液進行萃取，渦旋混合2分鐘；靜置分層后，^c ABA溶于下層磷酸液中，有色淬滅物質和^F ABA則溶于上層乙酸乙酯液中（回收率均96%）。

(2)^F ABA和有色淬滅物質的萃取分離：吸出50μl含^F ABA和有色淬滅物質的乙酸乙酯液置另1尖底試管（B管）中，加入100μl pH9.2的0.01mol/L的堿性磷酸鹽液進行萃取，渦旋混合2分鐘后靜置分層，此時有色淬滅物質仍在上層乙酸乙酯相里，^F ABA則溶于下層堿性磷酸鹽液中（回收率90%）。完成以上萃取分離步驟后，磷酸液中^c ABA和堿性磷酸液中^F ABA的含量即可用RIA測出。

3．ABA的放射免疫測定

所有樣液的轉移，操作皆在弱光下進行，溫育過程在4℃黑暗中進行。平行三管或雙管進行標準曲線和樣液ABA含量的測定。

本底管（N）、總計數管（T）和零標準管（B₀ ）分別加入200μl、150μl和50μl PBS液，各標準管（B）由稀至濃地加入50μl不同ABA濃度的標準液，樣品管（S）加50μl含^F ABA的堿性磷酸鹽液或^c ABA的磷酸液。接著在B₀ 管、B管和S管中加入100μl抗體稀釋液，渦旋混勻，4℃反應1小時。然后用微量進樣器分別在T管、B₀ 管、B管和S管中準確加入50μl³ H—ABA液，混勻，4℃反應1小時。然后于各管中加入0.5%BSA50μl，混勻后加入飽和硫酸銨（SAS）分離液250μl，立即混勻，4℃1小時。最后，用普通離心機3000r/min離心20分鐘，準確吸出400μl上清液至潔凈閃爍瓶內，加5ml閃爍液*，加蓋密閉，混勻，用無水酒精清洗閃爍瓶外壁，暗處存放1小時后用液體閃爍計數器測出上清液的放射性強度（^F cpm值）。表1為ABA放射免疫測定時的加樣順序。

4．計算

各測定值減去本底值后算出cpm的值。總計數管中未加抗體，測得cpm為管內³ H—ABA脈沖數總值（T）。其余各管測得cpm的值為F。T—F=Bcpm值，為沉淀物中給抗體結合了³ H—ABA的脈沖數。零標準管內沒有非標記ABA，T—F=B₀ cpm為抗體和³ H—ABA的最高結合值。各標準管計算B/F或B%（B/T×100%）或B/B₀ %（B/B₀ ×100%）和logit B/B₀ ，求得標準ABA濃度對抗體和³ H—ABA結合的競爭抑制率。以各標準管競爭抑制率（y軸）對2—cis( ) ABA濃度（x軸）作圖，繪制出如圖22、23的標準競爭抑制曲線。將B₀ 管33—35%的B%值定為抗血清工作濃度可以得到最為靈敏的標準曲線(r=－0.0981)，精確度和準確度也較好。檢測極限是0.18×10—¹² mol，抑制B/B₀ 50%需1.047pg，測定范圍達18×10—¹² mol。表2為一組制作標準競爭抑制曲線實驗數據處理的例子。

樣品管Bcpm換算成B/F或B%或B/B₀ %和logitB/B₀ 后，即可直接從具有相關、回歸和貯茂功能的電子計算器上，或者從標準曲線上查出ABA含量，再按下式算出試樣^F ABA含量和^c ABA含量。由于內源^c ABA主要是ABA—GE，抗體和ABA—GE的親和力大于抗體和ABA的親各力，因此計算試樣^c ABA含量時還應乘以交叉反應的折算系數1.46。

其中：3為提取液體積ml。

0.1為分離、萃取用樣液體積。

本實驗約需6─8小時。