脾臟組織單細胞懸液的制備方法

1. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入5mlF液及20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100目不銹鋼濾網(另購)過濾到試管內；離心沉淀1500轉/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗3次，每次以500rpm短時低速離心除去細胞碎片，以200目不銹鋼濾網（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為2×108-1×109個/ml的單細胞懸液備用。

2. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入70ml組織研磨器內，加入2mlF液及20%胎牛血清；緩慢轉動研棒，研磨至勻漿；用5mlF液及20%胎牛血清沖洗研器；收集細胞懸液，經200目不銹鋼濾網（另購）過濾；離心沉淀800rpm×2min ，再用細胞洗滌液洗3次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為2×108-1×109個/ml的單細胞懸液備用。

3. 酶消化法：    

A．用F液將膠原酶稀釋，終濃度為400 U/ml，至于冰浴備用。

B．取一適當大小培養皿進行操作：用鑷子夾碎動物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，37℃消化20分鐘。

C．以100或200目不銹鋼濾網（另購）過濾，離心沉淀800prm×2min ，再用細胞洗滌液洗3次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為2×108-1×109個/ml的單細胞懸液備用。

細胞計數方法:    

細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）進行。既可用于分離（散）細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于對培養物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數與計算過程

1）在細胞計數板*放置計數的蓋玻片。

2）用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。

3）置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數。

4）按下式計數細胞懸液的密度： 細胞密度＝（4個大格細胞總數/4）×104個/ml×稀釋倍數

公式中乘以104 因為計數板中每一個大格的體積為：

 1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

細胞計數要點： 

A．進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；顯微鏡下計數時，遇到2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數<200個/10mm2或>500個/10 mm2時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

B．要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

C．取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；

D．數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。