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腺病毒的包裝，純化和感染
技術背景：Adeasy 系統利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優點，
并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、高效的病毒載體。
利用帶有E1 基因的293 細胞作為包裝細胞，通過倍比擴增，富集病毒顆粒，并
通過CsCl 梯度離心，透析進行分離純化。對絕大多數的細胞株可以達到近乎100
％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉染試劑都不
可避免的細胞毒性問題。
所需試劑：
? 293 細胞；
? 重組好的腺病毒質粒；
? Pac I 限制性內切酶；
? 質粒回收相關試劑；
? 細胞培養、轉染相關試劑；
? TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl, pH8.1;
? 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；
? 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；
? Beckman 離心管：14*89 mm，SW41 轉頭；
? Polybrene (sigma)，10 mg/ml；
? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供應，帶少量甘油，硫化物與重金屬），
MW=8000~14400；
? 滅菌甘油。
操作流程：
1. 293 細胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在轉染前24 小時接種
于1 或2 個60 mm 培養盤中，使之在轉染時細胞匯合率為50-70%；
2. 在轉染前，用Pac I 處理目的質粒（一般一個60 mm 細胞盤需要6μg DNA）。
處理后質粒用乙醇沉淀并重懸于20 μl 無菌水中；
3. 用PEI 或其他轉染試劑將6 μg Pac I 處理過的質粒轉染細胞；
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4. 8 個小時后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培養液（10% CBS，1%
Pen/Strep）；
5. 在轉染后7 到10 天用細胞刮（而不是胰酶）將細胞從瓶中刮下并移入50ml
錐形管。離心后將細胞重懸于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中凍結細胞，
37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進行4 次。注意保存時不要反復凍融，
可保存于-20℃；
6. 將293 細胞以50-70%的匯合率鋪于60 mm 培養盤中，以30-50%的體積比加
入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明顯的細胞裂解或CPE 現象；
7. 在有1/3 到1/2 的細胞脫離漂浮時，通常是感染后3-5 天收集病毒。可進一
步通過Western blot 或PCR（5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，
55℃消化1 小時，然后煮沸樣品5 min，離心后取1-2 μl 進行PCR 反應）證
實重組腺病毒的存在；
8. 按步驟5 的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107 infectious
particles/ml 的病毒。每輪的擴增應能提高一個數量級的梯度；
9. 為了進一步擴增，將步驟8 獲得的病毒上清進一步感染100 mm 培養盤的細
胞，按步驟5 的方法收集病毒，并進而將其感染150 mm 細胞培養盤中的293
細胞，以獲得足夠量的病毒；
10. 將15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 離心管中制備CsCl 梯度溶液；
11. 將最終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上；
12. 超速離心，30000 rpm，4 度離心16 個小時；
13. 離心后，應有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具
感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用
16 號針頭將這一條帶收集；
14. 在TBS 中透析一小時，隨后在含有10％甘油的TBS 中透析兩次，每次一小
時；
15. 將純化的腺病毒分裝于EP 管中；
16. 在Eppendorf Biophotometer 中測量透析液中的總蛋白量，1μg 病毒蛋白相當
于4×109 病毒顆粒；
17. 長期保存于-70 度中，短期可保存于4 度，切忌反復凍溶；
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18. 由于腺病毒對不同細胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細胞毒
副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細胞數1：1，
10：1，100：1，1000：1 的病毒顆粒感染靶細胞；加入相對培養液體積1：
1000 的Polybrene。在37 度下平板離心30 分鐘；
19. 感染8~12 小時后換液。將含有病毒的培養液小心移入含有消毒液的廢液缸
中，加入適量全培液。
參考文獻：
1．Proc. Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 95, pp. 2509–2514, March 1998，A simplified
system for generating recombinant adenoviruses.
2．Current Protocols in Human Genetics (2004) 12.4.1-12.4.25.