腺苷酸環化酶的電鏡酶細胞化學試驗方法

　　腺苷酸環化酶主要分布于細胞質膜、核膜和內質網膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－環磷酸腺苷（cAMP）并釋放出焦磷酸。

　　Howell等人（1972）首先用亞胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地對動物細胞中的腺苷酸環化酶進行了定位。現已確認，在未固定和固定的組織中，ATP－PNP是腺苷酸環化酶的專一性底物，在腺苷酸環化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者與捕捉鉛離子反應，生成一種不溶性的電子密度很高的產物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點， Fujiomto等（1981）設計了使用二鉀亞砜（DMSO）的硝酸鉛法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸鉛法。

　　固定：配制固定液的緩沖液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩沖液，內含8%蔗糖、5%的DMSO。

　　固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對于肝臟來說，1%以上的戊二醛固定時，可導致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存。總體來說，多聚甲醛與戊二醛的濃度應因組織而異。一般在0～4℃固定2小時或室溫固定1小時。

　　洗滌：用配制固定液相同的緩沖液漂洗1小時～過夜，期間更換緩沖液數次；而后進行厚切片；

　　孵育：配方及條件見\ref{table:Enzyme-7},

　　作為腺苷酸環化酶特異底物的AMP－PNP在室溫中或長期冷凍保存時，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，應引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP 容易受到組織的堿性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在堿性磷酸酶活性高的組織內，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環化酶的激活劑，應根據組織不同進行前處理后，將氟化鈉加入到孵育液中。

　　后固定：后固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩沖液進行充分洗滌。

　　殘存的DMSO可以與鋨酸反應，產生擴散性的微細顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩沖液配制的1%～2%的鋨酸。鋨酸后固定時對酶反應產物有一定的影響，有人認為固定時間不應超過10min，超過后可引起酶反應產物顆粒變粗變大、擴散，有時由于全部溶出而導致完全沒有反應產物的陰性結果。因此認為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內。也有用2～4%的戊二醛代替鋨酸進行后固定。