試劑、試劑盒 結合緩沖液 [125I] 胰島素 (受體級) 牛血清白蛋白豬胰島素
實驗步驟
材料
牛血清白蛋白（BSA，1%)
豬胰島素〔17.5/umol/L(0.1 mg/ml) 于 0.001mol/LHC1 中〕（如 Sigma Chemical Co.13505)
[125I] 胰島素 (受體級)(DuPontNEN NEX 196)(2200uCi/mmol，35.5nmol/L)
試劑
結合緩沖液（供兩點結合試驗法用)
(配方，見“試劑的配制” PP.234~240)
操作程序
1) 于兩只微量離心管中各加 40ul 大鼠肝的質膜（20 mg/ml), 記作#1 和#2。
2) 各管加 30ul 1%BSA。
3) 各管加 140ul 結合緩沖液 。
4)#2 管中加 60ul 17.5umol/L 豬胰島素 (使終濃度為 3.5umol/L）,#1 管中加 60ul 蒸餾水。
5) 各管加 30ul 5nmol/L[125I] 胰島素（使 [125I] 胰島素的終濃度為 0.5nmol/L)。
6) 離心管置旋轉搖床上室溫孵育 2 h，或 4°C 孵育 16 h。
7) 離心管置微型離心機中離心 20 min。盡可能多地取出上清。
注：如配體對受體親和性高（如 KD=10-11), 可洗滌沉淀以去除游離的配體。不過，若配體對其受體只有低的或中度的親和性，則洗滌可能會部分解離配體-受體復合物。
8) 用 y-計數器測量管中的放射性強度。從#1 管的 cpm 值（總 cpm 值) 減去#2 管的 cpm 值（非特異結合計數和本底計數)，即得特異結合 cpm 值。
胰島素結合量的計算
激素-受體相互作用的標準公式通常表示為
式中，[H] 是游離配體的濃度，[R] 是游離受體的濃度，[HR] 是激素-受體復合物的濃度。達成平衡時，解離常數為
因此，[H] = [H]t - [HR](式中 [H]t 為配體的總濃度)，[R]t = [R] + [HR] (式中 [R]t 為受體的總濃度)。重排等式，則可得 KD 為：
對于兩點結合試驗，可假設鼠肝胰島素受體的 KD 為10-9mol/L。于是，可根據測出的 [HR] 和 [H] 計算出受體的總濃度 [R]t。
為確定比活性，可由“胰島素結合量”除以樣品中的蛋白量，或由 [R]t 除以試管中的蛋白濃度得出。此計算結果通常以 pml(結合胰島素)/mg(蛋白）來表示。