• <table id="4yyaw"><kbd id="4yyaw"></kbd></table>
  • <td id="4yyaw"></td>
  • 發布時間:2020-07-14 17:12 原文鏈接: 膜片鉗記錄和分析技術(一)

    細胞是動物和人體的基本組成單元,細胞與細胞內的通信,是依靠其膜上的離子通道進行的,離子和離子通道是細胞興奮的基礎,亦即產生生物電信號的基礎,生物電信號通常用電學或電子學方法進行測量。由此形成了一門細胞學科—電生理學(electrophysiology),即是用電生理的方法來記錄和分析細胞產生電的大小和規律的科學。

    早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術作細胞內電活動的記錄。現代膜片鉗技術是在電壓鉗技術的基礎上發展起來的。

    1976年德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann創建了膜片鉗技術(patch clamp recording technique)。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的(或多個的離子通道分子活動的技術)。以后由于吉歐姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的確立和幾種方法的創建。這種技術點燃了細胞和分子水平的生理學研究的革命之火,它和基因克隆技術(gene cloning)并架齊驅,給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。

    這一偉大的貢獻,使Neher和Sakmann獲得1991年度的諾貝爾生理學與醫學獎。

    一、膜片鉗技術發展歷史

    1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時,記錄到ACh激活的單通道離子電流,從而產生了膜片鉗技術。

    1980年Sigworth等在記錄電極內施加5-50 cmH2O的負壓吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),大大降低了記錄時的噪聲實現了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。

    1981年Hamill和Neher等對該技術進行了改進,引進了膜片游離技術和全細胞記錄技術,從而使該技術更趨完善,具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時間分辨率。

    1983年10月,《Single-Channel Recording》一書問世,奠定了膜片鉗技術的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻,榮獲1991年諾貝爾醫學和生理學獎。

    二:膜片鉗技術原理

    膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來(見右圖),由于電極尖端與細胞膜的高阻封接,在電極尖端籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離,因此,此片膜內開放所產生的電流流進玻璃吸管,用一個極為敏感的電流監視器(膜片鉗放大器)測量此電流強度,就代表單一離子通道電流。

    膜片鉗技術的建立,對生物學科學特別是神經科學是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的(或多個的離子通道分子活動的技術。些技術的出現自然將細胞水平和分子水平的生理學研究聯系在一起,同時又將神經科學的不同分野必然地融匯在一起,改變了既往各個分野互不聯系、互不滲透,阻礙人們全面認識能力的弊端。

    這一技術的發現和基因克隆技術并架齊驅,給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。



    三:全自動膜片鉗技術

    膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”。是研究離子通道的最重要的技術。目前膜片鉗技術已從常規膜片鉗技術(Conventional patch clamp technique)發展到全自動膜片鉗技術(Automated patch clamp technique)。

    傳統膜片鉗技術每次只能記錄一個細胞(或一對細胞),對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作,它不適合在藥物開發初期和中期進行大量化合物的篩選,也不適合需要記錄大量細胞的基礎實驗研究。全自動膜片鉗技術的出現在很大程度上解決了這些問題,它不僅通量高,一次能記錄幾個甚至幾十個細胞,而且從找細胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現了自動化,免除了這些操作的復雜與困難。這兩個優點使得膜片鉗技術的工作效率大大提高了!簽于全自動膜片鉗技術的這些優點,目前已經廣泛的用于藥物篩選。

    四:膜片鉗技術的應用    

    1. 應用學科

    膜片鉗技術發展至今,已經成為現代細胞電生理的常規方法,它不僅可以作為基礎生物醫學研究的工具,而且直接或間接為臨床醫學研究服務,

    目前膜片鉗技術廣泛應用于神經(腦)科學、心血管科學、藥理學、細胞生物學、病理生理學、中醫藥學、植物細胞生理學、運動生理等多學科領域研究。

    隨著全自動膜片鉗技術(Automatic patch clamp technology)的出現,膜片鉗技術因其具有的自動化、高通量特性,在藥物研發、藥物篩選中顯示了強勁的生命力。   

    2. 應用的標本種類

    使用的標本種類繁多。從最早的肌細胞(心肌、平滑肌、骨骼肌)、神經元和內分泌細胞發展到血細胞、肝細胞、耳窩毛細胞、胃壁細胞、上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞、精母細胞等多種細胞;從急性分散細胞和培養細胞(包括細胞株)發展到組織片(如腦片、脊髓片)乃至整體動物;從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾卵母細胞發展到雞細胞、大鼠細胞、人細胞等等;從動物細胞發展到細菌、真菌以及植物細胞。此外,膜片鉗技術還廣泛地應用到平面雙分子層(Planar bilayer)、脂質體(Liposome)等人工標本上。

    3. 研究對象

    研究對象已經不局限于離子通道。從對離子通道(配體門控性、電壓門控性、第二信使介導的離子通道、機械敏感性離子通道以及縫隙連接通道等等)的研究發展到對離子泵、交換體以及可興奮細胞的胞吞、胞吐機制的研究等。


  • <table id="4yyaw"><kbd id="4yyaw"></kbd></table>
  • <td id="4yyaw"></td>
  • 调性视频