2. GFC/AEC/SDS-PAGE Separation
分離復雜的蛋白質混合物，如膜粗提物，需要兩個連續的色譜層析步驟。因此，必須獲得較大量（約 5 mg) 的增溶蛋白質樣品。這也有利于低豐度的蛋白質在 SDS-PAGE 電泳泳道上被分辨出來。由于分子篩色譜層析（GFC) 會稀釋樣品，因此它被用在第一步的色譜層析，經 GFC 層析后被稀釋的樣品經第二步的離子交換層析（IEC ) 后得到濃縮。下面介紹的是，擬南芥膜增溶蛋白用 Superdex 200 Highload 16/60 層析柱進行的 GFC 色譜層析實驗（見注釋 5) 。
( 1 ) 用 180 ml 洗脫緩沖液，1 ml/min 流速，室溫下平衡 GFC 層析柱。
( 2 ) 將新增溶的蛋白質樣品進樣到層析柱上。
( 3 ) 用 180 ml 洗脫緩沖液洗脫蛋白（0.5 ml/min) ，并設置 0.3 ml 的收集組分容積。
( 4 ) 將鄰近組分中蛋白質含量低于 500 μg ( 根據 280 nm 吸收估計的量）的組分合并在一起（見注釋 6) 。
( 5 ) 取 100 μg GFC 分離組分樣品，加入冷丙酮 [ -20°C，80% (V/V)] ，于 -20°C 下過夜，用以沉淀蛋白質。
( 6 ) 用微量離心機 4°C 下 17000 g 離心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白質樣品中加入 50 μl Laemmli 樣品緩沖液，渦旋振蕩，并超聲波振蕩處理（超聲波水浴中處理 15 min) ，重懸沉淀的蛋白質。
( 8 ) 按前述方法用 SDS-PAGE 分離 GFC 洗脫組分的蛋白質。
( 9 ) 按前述方法將上述的 GFC 分離出來的組分樣品（至少含 500 μg 的蛋白質）進行第二步 AEC 色譜層析，使用 Mono Q HR 5/5 ( Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）。
膜粗提物經 GFC/SDS-PAGE 分離后，得到較為復雜的蛋白圖譜，特別是在 40~70 kDa 區域內（圖 22-4)。當經過 GFC/AEC/SDSPAGE 分離后，可得到較為簡單的蛋白質圖譜（圖 22-5)，易于用 MALDI-TOF/MS 鑒定蛋白質（切下的蛋白質條帶含較少的蛋白質)。
3.4 胰蛋白酶膠內蛋白消化
( 1 ) 切下考馬斯亮藍染色的條帶。
( 2 ) 用 2 ml ( 在 2 ml 離心管中）洗膠液充分沖洗切下來的膠粒至完全褪色，一般來說，兩次 4 h 的脫色沖洗可完全脫去膠粒的顏色。
( 3 ) 將褪色的膠粒在純乙腈溶液中脫水處理 1 h。
( 4 ) 用真空干燥器完全干燥膠粒（30 min)。
( 5 ) 4°C 條件下，用消化緩沖液制備新鮮的胰蛋白酶溶液（0.02 μg/μl)，防止酶的自身消化，置冰上備用。
( 6 ) 將干燥的膠粒置于小離心管中，滴入 15 μl 的胰蛋白酶溶液，將管子插入冰中，水化膠粒。30 min 后，膠粒上只有薄薄的一層胰蛋白酶溶液。當初始加入的胰蛋白酶液滴被膠粒完全吸收后，加入 15 mmol/L 碳酸氫銨緩沖液，使膠粒周圍包裹一層薄薄的碳酸氫銨。如果初始加入的胰蛋白酶溶液未被膠粒完全吸收，吸出多余的胰蛋白酶溶液，使膠粒周圍只有一層薄薄的胰蛋白酶（見注釋 7) 。
( 7 ) 將裝有膠粒的離心管封口，37°C 至少保溫 5 h，也可保溫過夜。
( 8 ) 加入 150 μl 肽段萃取緩沖液，20°C 保溫 3 h。
( 9 ) 去掉膠粒，用真空干燥器將 500 μl 離心管中的肽段萃取液濃縮至 5 μl。千萬不要將肽段萃取液完全干燥，因為那樣會使肽段吸附在管壁上而洗不下來。
3.5 MALDI-TOF/MS
在本書介紹的通用步驟（見第 19 章）之后，蛋白質將在靶上結晶，這里簡單闡述如下：
( 1 ) 用半飽和的 1:1 乙腈/水溶液新鮮配制 α-氰基-4-羥基肉桂酸，并用 0.1% TFA 酸化。
( 2 ) 將 0.8 μl 的蛋白質樣品與 0.8 μl 的基質混合，并立即點樣到靶上。
( 3 ) 讓樣品在靶上干燥和結晶。
( 4 ) 用超純水沖洗靶后，讓其干燥。
當譜圖穩定后，讀取譜圖（200~300 次激光轟擊，見注釋 8)。
3.6 數據庫檢索
現在有許多不同的搜索引擎可以用來鑒定已獲得肽質量的蛋白質，ProFound [10] 能夠很好地用來進行蛋白質混合樣品（最多可達 4 種蛋白質）的鑒定。在我們的分析中，總是假設為混合樣品（雖然也會出現最終的鑒定結果表示只有一種蛋白質)。檢索所用的參數如下：合適的物種分類范疇（擬南芥或釀酒酵母）；質量誤差為 0.1 Da ( 允許肽段質量偏離校準范圍的最大值 )；允許 1 個酶切缺失位點；蛋白質分子質量范圍：0~1000 kDa；pI 范圍：0~14；氨基酸未被化學修飾。考慮到混合物中可能存在的蛋白質種類的數量，可以進行最多 4 次改變可能的蛋白質的數量設置（最大設置為 4)。存取檢索運行中獲得的最高分值的結果。對于每個鑒定的蛋白質，實驗匹配質量用在最終的 ProFound “ 單個蛋白質” 檢索。最后，那些可能性接近 1，且 Z 分值高于 1.65 的蛋白質才予以考慮。