自噬雙標腺相關病毒說明（一）

一．關于自噬及LC3

1. 自噬

大自噬（macroautophagy），也就是通常說的自噬（autophagy），是真核細胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細胞質內的成分（細胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進而傳遞到溶酶體進行降解的過程。詳細來說，自噬過程與內涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無論通過哪條途徑，自噬溶酶體最終通過酸性水解酶將細胞器、蛋白等消化分解。

細胞本底水平的自噬發生在營養充足的條件下，可保護細胞免受錯誤折疊蛋白或受損細胞器的影響，從而防止某些疾病的發生（如神經退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導自噬的發生，通過降解大分子物質和細胞器為細胞活動提供營養和能量。

圖1 自噬過程及其與內涵體途徑的關系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

2. LC3 

LC3（light chain 3）簡稱于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的自噬相關蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產生細胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價結合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見圖2）。哺乳動物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為LC3的一種，同樣可以用作自噬的分子標志。

圖2  LC3在自噬體形成中的作用

(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)

二．自噬流檢測方法

細胞經自噬誘導或抑制后，需對自噬流的水平進行觀察和檢測，常用的技術手段見表1：

表1 自噬體計數及自噬流檢測方法匯總

（Mizushima et al, Cell, 2010）

其中，電鏡觀察法由于受到實驗條件和設備的限制應用范圍有限；而由于自噬過程發生快速，通過IB/WB檢測LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實驗進行時長的影響。

想要準確檢測自噬流的變化，需要多種技術手段共同使用，才能達到理想的實驗效果，產生具有說服性的實驗結果。

三．Vigene自噬雙標病毒產品

 四．Vigene自噬雙標系統的工作原理

未發生自噬的細胞及含有自噬體的細胞中，由于mCherry與GFP共同表達，細胞呈現黃色熒光。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進而使自噬溶酶體呈現紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻（見圖3）。

圖3 mCherry-GFP-LC3B雙標系統工作原理