一、 原理
黃色的噻唑蘭,簡稱MTT,可透過細胞膜進入細胞內,活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的針狀Formazan結晶并沉積在細胞中,結晶物能被二甲基亞砜(DMSO)溶解,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映細胞數量。
二、實驗步驟(實用于貼壁細胞)
1)收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,分于96孔板,每孔180μl,3000-10000個/孔。
2)置37℃、5%CO2溫箱培養使細胞貼壁,培養6-24小時。
3)加入待篩樣品20μl,繼續培養44小時。
4)小心吸去上清,加入80μl新鮮RPMI 1640培養液,再加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。
6)然后吸掉上清,每孔加入150 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。
7) 同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。
8) 計算抑制率=[(對照-空白)-(給藥-空白)]/(對照-空白)X100%.