色譜出峰異常現象診斷

液相色譜操作中經常遇到出峰異常現象，本文對兩種情況進行了研究和診斷，一是所用的液相方法中偶爾會出現色譜峰太小的問題，二是在空白對照溶液中出現樣品峰。

色譜峰太小

第一種情況源于一個分析片劑中藥物含量的方法。在完成系統適用性測試后，以對照品溶液進樣兩針，接著是5個樣品溶液，每個進樣2次；然后是一個由2針對照品溶液和10針樣品溶液組成的1個序列，重復進行，直到所有樣品全部測試完。問題出現了，偶爾或是20個樣品中會有1個，其峰面積比重復進樣的要低幾個百分點，超出了方法所允許的變化范圍。當再次將樣品進了兩針后，則發現結果都與之前分析中峰面積較大的那針相符。造成此現象的原因是什么？該采取什么方法來解決呢？

原因和解決方法并非顯而易見的，進一步的實驗有助于搞清楚產生這種現象的幾種可能。

針堵塞

有些樣品瓶的瓶墊很容易被進樣針穿透，是否是樣品瓶墊的碎片將針堵塞了呢？目前使用比較多的瓶墊是墊的底部為PTFE（聚四氟乙烯）膜，頂部為聚合物膜。如果瓶墊被針切割下來一小片，則可能會滑落到針孔里，造成堵塞。如果將瓶墊換成中間有裂口的，或只涂有PTFE膜的瓶墊可能會使這種情況得到改善。有時進樣針的損壞也會使針尖變得粗糙或者很鋒利，因此，進樣針不是穿透瓶墊而是如切割一般時，可以采用更換新的進樣針來消除。

樣品中顆粒性的物質也會產生與瓶墊碎片堵塞進樣針同樣的問題。進樣前每一個樣品溶液都須過濾或者離心，確保沒有懸浮的顆粒物存在。還有一種可能是流動相或者泵密封墊的磨損。如果推測有任何一種可能性存在的話，那么從根源上解決才是有效的辦法。在自動進樣器之前增加一個0.5μm的多孔在線過濾器，可以將流動相中的顆粒物濾掉，避免污染自動進樣器而造成堵塞。

氣泡

如果進樣時氣泡被吸入或者隨著樣品溶液被吸入進樣針中，那么進樣體積就會比實際的低，自然就會出現峰面積小的問題。所以需確保進樣針及與其相連接的管路是否完全用流動相充滿，沒有氣泡。對于粘度大的樣品，吸取的速度過快會造成進樣針中混入氣泡，而導致精密度下降。大多數的自動進樣器配有速度可調的進樣針來吸取粘度大的樣品。如果樣品溶液粘度非常大，調整吸取樣品溶液的速度可能會改善上述現象。

數據回顧

回顧和查看以往的數據對于確定所發生錯誤的頻率及可能存在的形式是很有幫助的。例如，問題是不是總出現在樣品溶液中，還是也會出現在對照品序列中？錯誤是否總是發生在序列的某一位置（例如每5個樣品溶液的最后兩個）？錯誤的數量恒定嗎？或者它會由一種錯誤轉變為另一種嗎？這些錯誤真的是獨一無二或者遠遠超出平均值嗎？將所有結果以繪圖的形式表示，來觀察這些錯誤值對于平均值來說是否呈現所期望的高斯分布，這些樣品的誤差是否只是超出可接受的范圍，但仍在高斯曲線之中？如果是這種情況，則說明儀器沒有任何問題，而是采用的方法可能含有太多的變量。

進一步的研究

如果通過上述改變儀器參數及數據回顧，仍不能獲得解決辦法的話，采用減少變量的方法進行進一步的研究也許是有用的。通過增大樣品溶液體積，或者將樣品提取液合并到一個小瓶中，這樣可以去掉樣品-樣品之間的變量。采用同一樣品瓶溶液多次進樣的序列，例如，在過夜的情況下連續50次進樣，這樣的序列有問題嗎？如果有，是否存在一種模式或者頻率能夠用來跟蹤產生問題的根源？同樣可以用對照品溶液來進行上述試驗，來觀察問題的出現與樣品溶液有關還是與對照品溶液有關。如果兩種溶液均有問題出現，那么問題一定在于儀器。如果問題只在一種溶液中出現，那么可以確定問題的產生與溶液的種類有關。

自動進樣器性能檢測

在進行自動進樣器性能的檢測時，采用色譜行為很好的樣品非常有幫助。例如，采用2μg/ml的蒽的溶液，以C18柱運行樣品，設定流速為1~2ml/min，檢測波長254nm，10μl進樣，流動相為甲醇:水80:20（v/v）（流動相選擇應使保留因子k在4~5之間，對于150mm×4.6mm的色譜柱，保留時間在4~9min）。在這種色譜條件下，進樣量為10μl。其相對偏差應該符合自動進樣器的規定，希望最大RSD為 1%。在此條件下，很多自動進樣器的RSD在0.3%~0.5%。如果上述操作是定期系統檢查的一部分的話，比較一下以往的結果。如果在此條件下系統的性能不是非常好，那么在樣品測試時不可能出現更好的表現。以上討論可以發現錯誤的類型及產生的原因，一旦這些被發現，應采取校正來解決問題，定期的系統和維護可以避免將來這些問題的發生。

多余的色譜峰

第二個問題依然源于測定片劑中藥物含量的方法，該方法在測定藥物含量時顯示非常好，但在測定片劑空白（除了藥物主成分以外的所有成分）時出現了問題，在主峰的保留時間處出現了一個很小的色譜峰。該片劑每一種輔料單獨進樣，發現只有在分析聚合物輔料的時候才會出現上述小色譜峰。是什么導致這種現象產生的？該怎樣消除？如果無法消除，是否能在計算藥物濃度時將該峰峰面積從背景空白中減掉？

在我看來，以下兩者之一的可能性會存在。一是聚合物輔料可能被藥物污染或者含有另外一種物質，會和藥物一起被洗脫下來。另外，由于聚合物的存在使藥物釋放在系統中，導致在聚合物進樣時出現藥物的色譜峰，該如何解決這一問題？

被污染的賦型劑

第一種情形是最容易被檢測的。如果可以的話，換一臺裝有新的色譜柱，新配制的流動相，并且沒有進行過上述分析的液相色譜系統；如果沒有辦法找到第二臺液相的話，徹底清洗整個系統，更換掉流動相儲液瓶，更換新的色譜柱。重復進樣聚合物溶液，觀察是否有干擾峰的出現。如果仍有色譜峰產生，它一定源于聚合物輔料本身。如果該色譜峰沒有出現，則聚合物沒有被污染，接下來應采取第二個行動。如果出現干擾峰，重新用新的批次制備聚合物樣品溶液，注意所有使用的玻璃容器、pH計以及所有在藥物主成分樣品制備時使用的裝置應非常潔凈，確保沒有污染產生。如果新的聚合物樣品結果非常好，那么舊的被污染的樣品則不能使用了。如果干擾峰始終存在，必須搞清楚該峰是否的確是藥物主成分的色譜峰或者是其他化合物與主成分共同洗脫下來的。這時就需要采用另外的分析方法，在不同的色譜條件下運行樣品溶液（例如不同的色譜柱，不同的流動相，或者不同的分析技術）。如果可以使用LC-MS，可以比較一下藥物樣品中的色譜峰與干擾峰是否為同一化合物。如果干擾峰是另外的化合物，從質控的角度該化合物應被視為不純物對待，在分析時應從藥物的主峰峰面積中減掉。如果藥物成分色譜峰總是在聚合物中出現（極少有的情形），那么必須找到不含藥物成分的聚合物賦型劑。

藥物成分結合在系統中

如果聚合物賦型劑顯示沒有藥物殘留了，很有可能是聚合物在液相系統中被藥物結合。其結合的位置一定是在從樣品瓶到色譜柱前端這段過程，如果藥物是在色譜柱里面被結合或者釋放的話，則其保留時間一定與運行的藥物樣品溶液本身不同。由于儀器部件在非良好洗脫情形下對藥物的吸附而導致單純的殘留是不太可能的，因為如果這樣，當沒有聚合物的空白樣品運行的時候，也應該出現干擾峰。檢查自動進樣器的沖洗過程，改變洗脫溶劑使得藥物的溶解度得以提高，例如改變pH值或有機溶劑。如果問題仍然存在，儀器內部的一些更換則很有必要。例如，可以從更換定量環和其他材質的連接管路開始，不銹鋼管可以用PEEK管（聚醚醚酮）或鈦材質的管路取代。如果這樣做仍不能解決問題，則可以更換其他材質閥的轉子。很多進樣器制造商可以提供多種選擇的轉子密封墊。另外，在線過濾器和保護柱也會導致上述殘留問題的產生，所以將這些可能產生問題的部件暫時拿掉，看看是否有不同的結果。希望這些改變可以找到問題的根源，并消除它。