色譜及質譜常用定量方法

　　色譜及質譜檢測中往往需要對目標物質進行定量，目前使用較多的定量方法有面積歸一化法、外標法、內標法、標準加入法等。

　　定量分析基本要求：

　　1、純物質做標準

　　2、被定量組分峰要與其它峰達到基線分離（質譜可不滿足）

　　3、符合定性參數要求

　　4、選擇合適的定量方法

　　定量分析基本公式：

　　在某些條件限定下，被測組分濃度與檢測器的響應值成正比關系。（蒸發光散射檢測器濃度與峰面積不成線性，分別取對數后成線性）

　　C_i=f_iA_i或C_i=f_iH_i

　　C_i：組分濃度

　　f_i：響應因子（與組分的理化性質和檢測器的性質有關）

　　A_i：組分響應面積

　　H_i：組分響應高度

　　實際修飾公式：Y=aX+b

　　一、面積歸一化法

　　把所有出峰的組分含量之和按100％計的定量方法，稱為歸一化法。當樣品中所有組分均能流出色譜柱，—并在檢測器上都能產生信號的樣品，可用歸一化法定量，其中組分i的質量分數可按式計算:

　　歸一化法定量的主要問題是質量校正因子的測定較為麻煩，雖然一些校正因子可以從文獻中查到或經過一些計算方法算出，但要得到準確的校正因子，還是需要用每一組分的基準物質直接測定。氣相色譜的一些主要檢測器如FID和TCD對某些組分，如同系物的校正因子相近或有一定的規律，從文獻中可以查到或進行計算。當校正因于相近時，可直接用峰面積歸一化進行定量分，例如下表中給出了C8芳烴異構體的分析結果。四個組分的FID檢測器的質量校正因子在0.96-1.00之間，結果給出了用校正因子進行歸一化法的定量結果和直接用峰面積進行歸一化的定量結果。比較兩個結果，誤差很小。在這種情況下直接用峰面積歸一是十分方便的，也是誤差范圍所允許的。

　　用 途：

　　用于雜質檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。不能作為準確定量的方法，僅在特定情況下使用。

　　特 點：

　　1、無需校正（無標準曲線）

　　2、進樣量不嚴格要求

　　3、要求所有組分都流出并且被檢測到

　　4、要求所有組分的響應因子相當

　　5、FID用的較多，校正響應差異

　　6、假設所有fi均相同則

　　Wi%=mi/(m1+m2+m3+…+mi+…)*100%==Ai/(A1+A2+A3+…+Ai+…)*100%=Ci%

　　二、外標法

　　C_i=f_iA_i+b 標準曲線擬合公式，f_i -i組分工作曲線斜率

　　特 點：

　　1、實驗室最常用的定量方法，定量結果較為準確

　　2、不需要所有峰都流出或被檢測到，只對目標組分校正

　　3、需要標準品

　　4、進樣量必須準確

　　5、儀器必須有良好的穩定性

　　6、每個樣品分析的色譜條件（檢測器響應性能、柱溫、流動相組成及流速，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現較大誤差

　　7、對樣品前處理過程中被測組分的變化無法進行補償

　　三、單點校正法

　　當被測試樣中各組分濃度變化范圍不大時，可不必繪制多點標準曲線，而采用單點校正法（直接比較法）。配制一個和被測組分含量接近的標準溶液，定量進樣，依據被測組分和外標組分峰面積比或峰高比計算被測組分的含量。

　　W_i=f_iA_i，W_S=f_SA_S，f_i=f_S

　　W_i/W_S=A_i/A_S

　　i-被測組分；S-標準液組分

　　缺 點：

　　單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在較大系統誤差時（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。

　　四、內標法

　　內標法的關鍵是選擇合適的內標物。

　　試樣配制：準確稱取一定量的試樣W_i，加入一定量內標物W_IS

　　W_i=f_iA_i，W_IS=f_ISA_IS

　　W_i=f_iA_i/f_ISA_IS*W_IS=f_i'A_i/A_IS*W_IS

　　f_i'為待測組分i對內標物IS的質量校正因子

　　將C_IS化歸為1則橫坐標即可直接讀出目標物濃度值C_i

　　特 點：

　　1、多用在國際標準和規定比較嚴格的方法中

　　2、臨床上檢測內源性化合物應用較多

　　3、進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內標法定量結果影響不大

　　4、樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內標物，可部分補償被測組分樣品前處理過程的損失

　　5、樣品中必須加入等量的同一內標物

　　6、操作相對繁瑣

　　7、內標物的選擇較困難

　　內標物選擇：

　　1、樣品中不存在且理化性質與待測物一致

　　2、不與樣品中組分發生化學反應

　　3、內標物與待測物響應相近

　　4、內標物與待測物既能較好的分離，又不相距太遠（質譜法同位素內標物除外）

　　5、內標物與待測物峰面積比在0.7-1.3范圍內最好（根據待測物濃度確定內標物的添加量）

　　6、常用的內標物有同系物以及質譜法常用的同位素內標物如氘代內標

　　五、標準加入法

　　標準加入法可以看作是內標法和外標法的結合。當選擇不到合適的內標物或無空白樣品時，以待測組分的純物質為內標物加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入待測組分純物質前后的峰面積（或峰高），從而計算待測組分在樣品中含量的方法。

　　具體操作是取等量待測樣品若干份，加入不同濃度的待測組分的標準溶液進行分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制工作曲線。工作曲線延長線在橫坐標上的截距即為樣品中待測組分的濃度。由于待測組分以及加入的標準溶液處在相同的樣品基體中，相當于把待測試樣作為了背景值。

　　但是，由于對每一個樣品都要配制三個以上的、含樣品溶液和標準溶液的混合溶液，因此，這種方法不適于大批樣品的分析。

　　W_i+W_添加=f_i'A_i'

　　當f_i=f_i'時，(W_i+ W_添加)/W_i=A_i'/A_i，即W_i= W_添加/(A_i'/A_i-1)

　　特 點：

　　1、只需欲測組分的純物質，不需另外選擇內標物

　　2、進樣量要準確

　　3、兩次色譜條件完全相同以保證校正因子完全相等

　　4、若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的待測組分，則可以補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法

　　5、缺點是要求加入待測組分前后兩次色譜條件完全相同，以保證兩次測定時的校正因子完全相等，否則將引起分析測定的誤差

　　應用外標法能夠滿足要求，首選外標法，畢竟外標法簡單省事。單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，內標法優于外標法。對結果精密度和準確度要求高時采用內標法還是必要的。

　　內標與外標都是定量的一種方法，各有優缺點，要綜合考慮分析領域，分析要求和以及分析成本和分析效率等方面來選擇定量方法，找到簡單而有效的定量分析法才是最重要的。