色譜峰裂分、前拖尾的診斷

在液相色譜中分離中，幾乎很少色譜圖沒有峰拖尾的情形。在反向色譜分離過程中，色譜峰拖尾主要是由于副反應造成的結果，尤其是在硅膠鍵合的固定相中堿性或酸性化合物與少量的金屬雜質所發生的離子交換或相互作用。

這些峰拖尾的問題通常只是發生在色譜圖中一個或少數幾個色譜峰，但是對于那些所有色譜峰都出現峰拖尾、裂分或出現雙峰的現象又該如何解釋呢？另外有些色譜峰還會出現很糟糕的前沿，這對大多數色譜工作者來說并不多見，但在特定條件下卻很普遍。本文將對這兩種問題進行探討。

反向使用色譜柱

曾有讀者寄給我兩張色譜圖（圖1），他在分析樣品時發現，所有色譜峰均出現裂分，呈現雙峰，見圖1（a）。同一樣品重復進樣，結果依然如此。更換其它樣品進樣，同樣色譜峰出現雙峰。這時他覺得會不會所有的樣品都會有同樣問題。然后他用對照品重新進樣，得到色譜圖，見圖1（b）。由于該實驗室分析條件有限，只有一臺LC，也沒有多余的色譜柱，因此限制了他采用最有效的解決辦法，用一個已知的好的配件來替代有問題的。盡管如此，他還是做他能做的，重新配制流動相及自動進樣器清洗液，但是都沒有得到改善。用乙腈充分沖洗整個色譜系統，使色譜柱、泵、自動進樣器及檢測器得到清洗，依然無法消除峰裂分的現象。最后，他無奈將色譜柱掉轉方向使用，令人驚奇的是對照品的色譜峰由雙峰變為了單峰。重新將樣品溶液進樣，同樣，每一個組分均顯示為單峰。由于擔心色譜柱的安裝方向與所指示的相反，他又將色譜柱重新按照通常的方向安裝，結果以上所述問題再次出現，這就是他為什么寫信求助的原因。

圖1.  色譜柱部分堵塞導致的峰裂分色譜圖，（a）為樣品，（b）為對照品。

圖2.  柱塞板部分堵塞（a, b）及柱塌陷（c）的色譜峰特征。

經典的色譜圖

這個問題是很容易從色譜圖看到的。事實上，這是一個很典型的我常常稱之為“特征色譜圖”的問題。它歸結于兩種色譜柱問題——柱篩板部分堵塞或者色譜柱頭塌陷。圖 2 所示即為這種問題導致色譜峰改變的例子。常見的現象為色譜圖中每一個色譜峰均出現同樣的變形，裂分成雙峰，拖尾或其他意想不到的峰形。好的色譜柱情形如圖3（a） 所示，色譜柱頭的篩板使得樣品均勻地分布在色譜柱的頂端。

由于這時還沒有進行樣品的分離，故每一股樣品溶液都含有所有樣品組分成分。它們在同一時間達到固定相，這時分離過程開始，在色譜柱中，化合物遷移速度的不同導致化合物的色譜分離。如果安裝在色譜柱前端的柱篩板部分堵塞了，此時的情形如圖3（b）所示，部分樣品可以以通常的方式到達固定相表面，而另外一些則被堵塞的柱篩板擋住了，它們需要走更長的路繞過被堵塞的部分到達固定相，因此，這部分樣品溶液就比其它沒有被阻斷的部分要晚些達到固定相。由于此時還沒有進行柱分離，所以這個過程的結果導致一部分樣品溶液先于其它部分開始流向色譜柱。就好象轉眼之間發生了兩次進樣過程。從色譜圖中就會看到雙峰的出現，后者稍稍滯后前者。

圖3.  流動相通過色譜柱時的流向示意圖，箭頭所示為樣品進入柱分離前段情形：（a）為正常流向，（b）為因柱篩板部分堵塞引起的流向改變，（c）為色譜柱塌陷引起的流向改變。

反向沖洗色譜柱或許能再次除去篩板上的污染物，因此可以恢復正常的流速及色譜峰形。有的時候反向沖洗可以解決峰裂分的問題，甚至將色譜柱再按正常方向使用。但在另外的情形中，反沖色譜柱可能是無效的或者只是在反向使用色譜柱時有效。可能是因為有些污染物強吸附在柱篩板上，在反向沖洗色譜柱時不能有效地將它們除去。

操作中的注意事項

反向沖洗色譜柱常常可以有效地除去吸附在色譜柱前端的顆粒污染物，但是需要提醒的是，第一，反向沖洗色譜柱時，要將出口端（原來的入口端）直接通入廢液中幾分鐘，然后再接檢測器，因為如果污染物被洗下來，你肯定不希望沖到檢測器中，進而引起新的麻煩；第二，需要注意的是，色譜柱是否可以反向沖洗。如果色譜柱填料的粒徑是5μm 或者更大，通常使用2μm 多孔柱篩板，此種色譜柱可以反向沖洗，不需要考慮太多，色譜柱上所表明的箭頭流向只是一個參考的標識。如果色譜柱的填料是3μm，由于其分布有一較寬的粒徑范圍，2μm柱篩板其孔徑通常不足夠小，以便有效地擋住所有填料。因此，常常用0.5μm 柱篩板安裝在色譜柱后端，0.5μm 孔徑是與裝在自動進樣器后面用來保護色譜柱的在線過濾器的孔徑一樣的。這種篩板很容易被堵塞，同樣的原因3μm填料的色譜柱比5μm的色譜柱更容易發生堵塞。消除柱堵塞的辦法之一是色譜柱入口采用2μm的篩板，出口采用0.5μm的篩板。2μm的篩板不易被堵塞，而且只要按照色譜柱上所標識方向使用也可以保留住填料顆粒不流失。以我的經驗，3μm填料配有2μm的篩板（入口）的色譜柱可以短時間反向沖洗，但不可長時間反向使用，否則可能會發生填料泄漏。對于最新的2μm填料的色譜柱，即使0.5μm的篩板，其孔徑都太大了，故采用0.2μm的篩板。我不是很清楚廠家是否在色譜柱前段配有0.5μm的篩板，出口端配有0.2μm的篩板。但是即使是這種情況，色譜柱反向沖洗時仍要注意。在反向沖洗色譜柱之前，最好咨詢色譜柱制造商有關色譜柱使用的注意事項，確保不損壞色譜柱。當然，最好的預防色譜柱堵塞的辦法是盡量減少色譜柱被顆粒污染物污染，這意味著樣品制備過程應包含除去雜質顆粒的過程。一些色譜工作者喜歡過濾所有樣品溶液，這樣做花費很高同時可能需要進行額外的驗證來確保樣品在過濾過程中不易丟失或者被過濾器帶入污染物。我更建議采用臺式離心機對所有樣品離心，然后移入樣品瓶中。

前沿峰

在反相色譜分離中，雖然峰拖尾現象無處不在，但前沿峰卻不多見。一些色譜工作者可能從來沒有見到過前沿峰。圖 4 所示就是一個例子。該方法采用C18柱，流動相為含有高比例的水相（95%的緩沖液）和高pH值（pH 9.0）。在大約進樣500次后，色譜柱出現異常，出現前沿峰。

圖4.  （a）為正常色譜圖；（b）柱為塌陷后的色譜圖。

色譜峰拖尾的根源常被輕易地描述為樣品（通常為堿性化合物）與硅膠鍵合柱的填充物發生化學副反應所引起的。但是前沿峰，更恰當的描述應該是色譜柱的物理變化造成的。色譜柱的塌陷導致樣品溶液的流路發生改變，如圖3（c）所示。在這個例子中，小部分樣品溶液可以很快地流經塌陷色譜柱部分進入固定相表面，走在了其余樣品溶液的前面，結果導致前沿峰的發生，如圖4（b）所示。但樣品中有多個色譜峰，則所有峰均顯示峰前沿的現象，如圖3（c）所示。在所列舉的例子中，其色譜方法存在兩個問題導致上述現象的發生。首先，流動相的pH值9.0，通常的高效液相色譜儀使用的硅膠基質色譜柱，其合適的pH值范圍為2 < pH < 8。如pH值低于2，鍵合相被水解掉，如果pH值高于8，硅膠可以趨于溶解。有一些色譜柱，如使用復合硅膠鍵合相，可以使用pH高于8的流動相。另一種選擇是用一種不易受到堿性物質腐蝕的聚合物填料的色譜柱。

另外的問題是圖4 所示的方法需采用高含水量的流動相（95%緩沖液）進而使被分析物達到合適的保留。改善的方法之一是使用極性鍵合相或水型“AQ”色譜柱，此種色譜柱很多廠家都有制造，可以使用100%水相作為流動相；另外一種方法是減少硅膠表面C18的覆蓋率，使更多的極性硅膠暴露在外面，至少有一家色譜柱制造商在使用該方法。色譜柱的類型如圖4 所示。

不幸的是，高pH值的流動相加上低 C18覆蓋率的色譜柱可能共同導致一些問題的發生，色譜柱在大約500次進樣后塌陷，色譜峰出現很差的前沿峰，見圖4（b）。幸運的是，色譜峰峰面積并沒有受到影響，所以在該批樣品定量分析盡管出現前沿峰，結果依然正常。當然，在接下來的樣品運行之前，色譜柱被替換下來。能猜測到在方法的開發和驗證過程中，這種致命的影響被忽視了，當意識到的時候，修正這一問題則需要進行方法的再驗證。我們發現測試數據對于分析來說已經足夠準確，并且分析方法運行超過10?000件的樣品時也表現的不錯。的確，更換色譜柱的花費很高，但是色譜柱的費用只是整個分析過程中的很小一部分開銷。對于一個LC/MS/MS方法來說，一個樣品的分析費用在在$50~$100，所以在連續進樣500次以后，花$500來更換一個色譜柱，費用只占總費用的2%以下，遠遠低于上述例子中對方法進行再驗證的花費。

結論

色譜柱進口端出現的物理問題可導致色譜峰裂分，雙峰或者峰前沿。這些問題常常需要更換色譜柱來解決。如果色譜柱的壽命及數據質量都可以的話，不必改變方法來避免上述問題。