色譜柱使用壽命延長的方法（一）

色譜柱的使用壽命，除了與所分析的樣品和流動相及使用頻率有關系外，最主要的是與日常的維護密切相關。為延長色譜柱的使用壽命，維護您的利益，請仔細閱讀此部分。
色譜柱的使用壽命主要是柱效和柱壓兩個指標來衡量，如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認為該色譜柱已經結束。因此，延長色譜柱使用壽命的關鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的日常維護方法：
一、流動相的PH應在使用的范圍內
    色譜柱除反相氰基柱PH1.5-9.0外，其反相色譜柱的PH范圍均為1.5-10，由于填料中存在Si-C和Si-O鍵，流動相超過其PH范圍將會導致硅膠基質流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，使用壽命變短。由于流動相的PH 控制不當而對色譜柱造成的損害，通常很難使色譜柱恢復，因此必須認真對待，嚴格控制流動相的PH值。
二、去除樣品和流動相中的固體顆粒
    樣品和流動相中含有的固體顆粒物質會堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會引起柱壓的升高，而且也會引起柱效下降，因為篩板的堵塞會引起液流不均，導致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議使用超純水和色譜純試劑，在分析樣品前對樣品進行針筒過濾，流動相過0.45μm濾膜。
三、使用保護柱或在線過濾器
    樣品和流動相經過濾后并不能完全消除固體顆粒物質，因為泵的磨損、密封圈和管路的老化也會產生固體顆粒物質，這些固體顆粒被流動相帶入色譜柱，堵塞篩板，導致柱壓升高、柱效下降。保護柱和在線過濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此可以阻止固體顆粒物質到達色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大 比例，因此，除對樣品和流動相進行過濾外，建議您在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器。
    如果確認色譜柱柱壓升高是由于進樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進行補救：
    1、先在色譜柱前加上保護柱或在線過濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
    2、先在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器，然后反向使用。
四、正確使用緩沖鹽
    緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機溶劑，因此緩沖鹽使用不當會使其析出，堵塞填料基質上的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結，柱壓上升；同時阻礙了基質上鍵合的碳鏈自由舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對延長色譜柱使用壽命非常重要。
    正確使用緩沖液的目的是防止緩沖鹽析出，因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結為一句話：使用前要過濾，使用后要沖洗。具體方法如下：
   1、等度條件：使用緩沖鹽前和使用后需用過渡流動相以1.0ml/min流速沖洗60min；使用后去除緩沖鹽的另一個方法是用過渡流動相以0.2ml/min流速沖洗色譜柱過夜。
   2、梯度條件：用含有緩沖鹽的流動相跑梯度之前，用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1.0ml/min流速沖洗60min，再用該過渡流動相以1.0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動相的梯度設定應盡量平緩，以避免梯度過程中緩沖鹽析出。
   注意：過渡流動相是指有機相和水相的組成與分析流動相相同，區別只是過渡流動相不含緩沖鹽。
   3、緩沖鹽析出的補救方法：
   1）方案1：用甲醇/20/80以1.0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min
   2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。
五、防止強保留物質在色譜柱上存留
    強保留物質和大分子化合物在色譜柱中累積，對樣品中的化合物產生額外的保留行為，不僅引起峰型變寬、拖尾，使柱效下降，同時也會引起保留時間的變化，累積到一定程度時還會導致柱壓升高。由于強保留物質和大分子化合物對色譜分離的影響是一個累積效應，需要一定的時間才會體現出來，但對許多藥品特別是復雜樣品而言，很難判斷其是否是含有強保留物質，因此要防止強保留物質的累積，需要在每天的日常維護中用純甲醇清洗色譜柱。
清洗方法：
   1、未使用緩沖鹽：每天分析完成后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后再用甲醇或反向沖洗色譜柱60min。
   2、使用過緩沖鹽：分析完成后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后在用純甲醇或乙氰反向沖洗色譜柱60min
   3、補救方法：
水——乙氰——（或異丙醇）——乙氰——水
每一步以1.0ml/min流速反向沖洗色譜柱60min。 

C18色譜柱的選用、保養與維修  
　　據統計，近80%的有機物及無機物可以用高效液相色譜法進行分離，其中反相色譜中的C18色譜柱是高效液相色譜中最為常用的一類色譜柱。下面就C18色譜柱的選用、保養與維修作一介紹。 

 1、C18色譜柱的選用

　　C18的選用主要考慮2個問題，即柱填料和柱規格對色譜柱的影響。 
1.1　C18柱的填料對色譜柱的影響　柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學、含碳量及烷基化處理。 
(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實際上色譜柱上所標的粒徑是一個平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實際上有一個顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。 
(2)孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結構均勻，柱效高，重現性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結構不均勻，流動相線性速度不均勻，譜帶擴寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應，或產生吸附效應從而影響定量的回收率及準確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料。孔體積作為硅膠多孔性的參數，在分離分析較大分子化合物時可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。 
(3)化學鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機基團，采用極性較小的溶劑作流動相。亦可鍵合極性較小的有機基團，選用極性較大的溶劑作流動相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應目前應用最為普遍。如以十八烷基與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應生成烷基化學鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18。