分離度（R） 用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測物質與某一指標性成分(內標物質或其他難分離物質)的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測物質與某一降解產物的分離度，對色譜系統分離效能進行評價與調整。
無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質色譜峰與內標物質色譜峰或特定的雜質對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.5。分離度的計算公式為：
式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間；
tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間；
W1、W2及W1，h/2、W2，h/2，分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬見下圖。
當對測定結果有異議時,色譜柱的理論板數(n)和分離度(R)均以峰寬(W)的計算結果為準。