色譜法分離釀酒過程中被修飾的麥芽蛋白

釀造幾乎是一個盡人皆知的簡單過程，看過張藝謀《紅高粱》的觀眾一定會對影片中所描繪的家庭式釀酒作坊中幾十號人汗流浹背、忙碌穿梭的鏡頭記憶憂新。但家庭釀造與商業釀造有明顯不同，前者中使用了麥精（malt extract）。工業生產中，釀酒師常常自己提取糧谷，以便能夠對發芽（malting）過程進行控制。

發芽是釀酒的一個關鍵步驟。發芽過程中，谷粒被誘導發芽，釋放淀粉轉化為糖，蛋白轉化為氨基酸所需要的酶。這些酶是釀造所必需的，待到谷粒開始抽芽時，釀酒師會將谷粒烘干，延長酶的活性。釀造開始時，釀酒師將發芽大麥浸沒在熱水中重新激活這些酶。于是淀粉開始轉化為糖，準備被酵母轉化為酒。

發芽過程中，谷粒中的蛋白也會受到影響，其中許多開始被出現的糖基糖化。某些富含脯氨酸殘基的經過修飾的蛋白使啤酒變混濁，另一些蛋白在泡沫形成和安定（stabilisation，生物通編者譯）中發揮重要作用。

大麥源性的脂質轉運蛋白(lipid-transfer proteins，LTP)和蛋白Z，是啤酒中的主要蛋白，泡沫中10％的高分子物質都是這兩種蛋白，剩下的大部分屬于碳水化合物。大麥LTP1的修飾形式與泡沫形成有關，未經修飾的形式是無活性的。糖化蛋白Z提高了啤酒泡沫的穩定性。

因為這些后翻譯修飾（post-translationally）的蛋白是釀造的核心，來自于有悠久釀酒歷史的捷克的研究人員摸索從發芽大麥中鑒別這些蛋白的方法。國際科學院委員會大麥和啤酒花提取物研究中心的Josef Chmelik 和Janette Bobalova，利用單向聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和質譜技術，未能清晰指出蛋白的修飾過程。部分原因是，PAGE受速度限制，工業設備最好采用速度快的技術。

二人打算采用色譜法，這種方法將多孔性單片聚合體作為固定相，適合離子交換、倒相（reversed-phase）、親合和疏水相互作用色譜(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)。將正規管柱（regular columns）的作用與和膜技術有關的對流傳質（convective mass transfer）相結合，通過高通量方法，加快了分離速度。

對于修飾的大麥蛋白，研究人員采用陰離子交換盤狀CIM柱和二極管陣列（diode array）探測法分離蛋白大麥芽水溶性提取物中的蛋白。根據鹽梯度，洗脫液被分為三部分，第一部分對應于第0－1.0分鐘內的尖峰，第二和第三部分分別對應第1.0－1.6和1.6－3.4分鐘內的較寬一點的峰。

接下來，研究人員利用基質輔助激光解吸電離質譜（matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry ，MALDI MS）鑒別各部分的蛋白。MALDI MS能夠探測蛋白的分子質量。第一部分中，質量為9991Da的蛋白對應的是被14-hydroxy-10,13-dioxo-7-heptadecenoic acid aspartate ester (CHDH)修飾的LTP1。進一步純化得到的三個峰分別是添加了一個、兩個或者三個由糖與蛋白中的賴氨酸殘基通過酶拉德反應（Maillard reactions）形成的己糖修飾的LTP1。

第二部分含有己糖修飾的LTP2。第三部分含有未經修飾的和添加了己糖的蛋白Z的C末端，還含有帶1－3個己糖殘基的LTP2。三個部分中的其它蛋白還能根據分子質量被分離出來。

蛋白首先在溶液中被酶切，經過SDS-PAGE后在凝膠內被酶切。這種過程也用于鑒別第一部分中未被修飾的LTP1，第二和第三部分中不完整的未經修飾的蛋白。

Chmelik和Bobalova推測，LTP1是發芽過程中的一個理想的后翻譯修飾標記物，可作為發芽質量參數，可被CIM色譜跟蹤，在頭一分鐘的尖峰內。

CIM過程對于需要快速出結果的工業設備非常理想。分析過程總共只有15分鐘，而雙向電泳則需要2天。