苯并(a)芘的高效液相色譜法測定

方法提要

利用正己烷-液-液萃取、固相萃取C18柱-二氯甲烷淋洗等提取水樣中苯并［a］芘，提取液經硅膠柱凈化、濃縮、定容后，高效液相色譜-紫外-熒光檢測器串聯分離檢測，外標法定量。

方法適用于地下水、地表水、飲用水及污水等水樣中苯并［a］芘的分析，其中固相萃取適用于潔凈水分析。方法檢出限隨儀器靈敏度和樣品基質而定。當取樣量為1.0L潔凈水時，本方法檢出限為0.50ng/L。

儀器與裝置

高效液相色譜儀帶紫外檢測器和熒光檢測器。

固相萃取裝置。

旋轉蒸發儀。

恒溫水浴氮吹儀。

振蕩器。

帶聚四氟乙烯活塞的1L分液漏斗。

固相萃取C18柱1000mg，6mL。

硅膠凈化柱1000mg，6mL。

分析柱WastersPAHsC18液相色譜專用柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm;或性質相似的液相色譜柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。

離心機。

試劑與材料

無水硫酸鈉、氯化鈉優級純，在600℃高溫爐中灼燒4h放置在干燥器中備用。

正己烷、二氯甲烷、丙酮等均為農殘級。

甲醇HPLC級。

替代物標準p-三聯苯稱取固體三聯苯替代物標準，以甲醇溶液溶解、定容，并用甲醇逐級稀釋為10.0μg/mL儲備液。替代物標準1-氟萘100.0μg/mL，有證標準物質。替代物標準均在-18℃下保存備用。

標準儲備溶液苯并［a］芘，-18℃下避光保存，購自國家標準物質中心。

1L棕色樣品瓶。

針頭過濾器及注射器針頭過濾器型號孔徑0.45μm，直徑4mm，聚四氟乙烯濾膜。

樣品采集與保存

采樣前不能用水樣預洗采樣瓶，采集時樣品要充滿整個樣品瓶，不留氣泡。樣品采滿后迅速放置在低溫冷藏箱中并盡快送實驗室檢測，到達實驗室后樣品應盡快轉移至4℃冷藏設備中保存。7d天內完成樣品提取、40d內完成檢測。苯并(a)芘對光敏感。在樣品采集、運輸、儲存以及分析全過程應盡可能避光操作，防止光解。

分析步驟

1)試樣提取。

a.液-液萃取。將1.0L水樣倒入預先加有30gNaCl的1L分液漏斗中，待NaCl溶解后加入50mL正己烷、5μL10.0μg/mL的p-三聯苯替代物標準溶液;并用20mL丙酮淋洗樣品瓶，淋洗液轉入分液漏斗，振蕩5min。靜置10～20min，將水相轉移至原樣品瓶，正己烷相轉入150mL平底燒瓶中。原樣品再進行第二次萃取，萃取方法同第一次，正己烷量減少為30mL。合并正己烷相，并加入3g無水硫酸鈉，稍稍搖動，觀察有無結塊現象，如有結塊，需補加無水硫酸鈉至沙狀，繼續放置20min，之后過濾至另一150mL平底燒瓶中，濾液旋轉蒸發濃縮至約3mL。如果是潔凈地下水，樣品可以不凈化，直接轉移至KD濃縮瓶中，氮氣吹掃至0.3mL，加入甲醇0.5mL，氮氣吹掃至0.3mL，再加甲醇0.50mL，氮氣吹掃至0.3mL，最后甲醇定容1.0mL，0.45μm濾膜過濾，HPLC測定。如污染較重，則需凈化。凈化方法見2)樣品凈化。

b.固相萃取(適用于潔凈水樣)。將固相萃取C18柱(1000mg，6mL)，安放在固相萃取裝置上，用10mL二氯甲烷淋洗C18柱，再用10mL甲醇分兩次淋洗C18柱(第二次甲醇浸泡5min)，最后用10mL空白水分兩次淋洗，等待上樣。在活化過程中不要讓柱子流干。在要富集的1.0L水樣中加入5g氯化鈉、40ng替代物標準p-三聯苯、30mL甲醇等混勻后樣品以5mL/min的流速流過已活化的C18柱。樣品流完后真空干燥3min后取下C18柱，以3000r/min離心10min除水。除水后的C18柱安裝回固相萃取裝置，用5mL二氯甲烷浸泡C18柱5min后自然流下，收集洗脫液。用4mL二氯甲烷洗滌樣品瓶并與樣品洗脫液合并。洗脫液中加入1g無水Na2SO4，振搖后放置15min，用滴管將洗脫液轉移至25mLKD濃縮瓶中，用2mL二氯甲烷洗滌Na2SO4相后并入KD濃縮瓶，加入0.5mL甲醇，氮氣吹掃至0.5mL，再入甲醇1.0mL，氮氣吹掃到0.5mL，最后甲醇定容至1.0mL，過濾HPLC測定。

2)試樣凈化。凈化硅膠柱預先用10mL10%丙酮-正己烷溶液、10mL正己烷活化后，待正己烷接近硅膠頂層時迅速將待凈化樣品提取液轉入柱中，先用5mL正己烷淋洗，棄之，再用25mL正己烷-二氯甲烷(1+1)混合溶液淋洗，淋洗液用KD濃縮瓶承接，氮氣濃縮，甲醇換相、最后定容至1.0mL，過濾HPLC測定。

3)校準曲線。用甲醇分別稀釋1.93μg/mL苯并［a］芘二級標準溶液，配制成0ng/mL、1.93ng/mL、9.65ng/mL、19.3ng/mL、28.9ng/mL、38.6ng/mL標準系列，每個標準系列點加入4μL的10.0μg/mL三聯苯替代物標準溶液。通過濃度與對應峰面積建立標準曲線。

4)高效液相色譜分析條件。流動相為甲醇溶液，流速1.2mL/min(恒流方式)，柱溫40℃。紫外檢測器(UV):波長254nm。熒光檢測器(FLD):0～6min，激發波長(Ex)250nm，發射波長(Em)370nm;6～15min，激發波長294nm，發射波長430nm.。

5)定性及定量分析。

a.定性分析。采用試樣中待測目標物保留時間與標準目標物保留時間相比較的方式進行定性分析。檢測方法采用熒光和紫外串聯檢測的方式。特別當有干擾存在時，應仔細分析熒光和紫外色譜圖排除干擾。如果試樣中待測目標物含量達到方法檢出限5倍以上，需GC-MS確證。

b.定量分析。采用熒光和紫外串聯檢測的方式進行定量分析。以熒光檢測定量為主，對有干擾存在應結合紫外檢測情況綜合確定。外標法定量。再根據試樣測定濃度、稱樣量計算出試樣中濃度。目標化合物峰面積和定量校準曲線可以由高效液相色譜儀工作站自動完成，定量校準曲線也可由EXCEL工作軟件完成。對自動積分的峰面積應逐一檢查各峰基線，對不合理基線進行必要修正。

對含量接近檢出限水平的試樣，可以采用與其濃度相近的標準單點校正。對于含量超過校準曲線上限的試樣應稀釋或減小取樣量，使其峰面積保持在校準曲線的線性范圍內，重新測定。

6)方法性能指標。分別配制質量濃度為19.3ng/L的苯并［a］芘、40ng/L三聯苯的空白加標試液1L，按試樣分析步驟進行分析，獲得方法精密度和加標回收率分別為2.07%和81.1%～93.0%(n=6)。

上述苯并［a］芘校準曲線的線性方程是y=55947x-5570.5，相關系數R2=0.9999。

將質量為3.86ng的苯并［a］芘標準分別加入到1.0L空白水樣中，余下同試樣分析，以3倍信噪比對應濃度作為方法檢出限，其方法檢出限為1.00ng/L。

色譜圖的考察(圖82.9):

圖82.9苯并［a］芘標準高效液相色譜圖(熒光檢測)

質量控制

每批試樣或至多20個試樣必須至少進行一個全流程試劑空白、一個平行雙樣和基體加標分析，以監測分析流程中玻璃器皿、試劑、溶劑和其他硬件帶來的干擾和與之相關的試樣分析精度，加標濃度不得低于原始試樣的背景濃度。

當分析超過 8h 或每分析 10 個試樣后，應用標準曲線中等濃度的確證標準檢查儀器的工作狀態，確證標準與最初標準相比偏離大于 20%，需重新測定標準系列; 若偏離仍大于 20%，需重新配制標準曲線和分析試樣。

替代物標準三聯苯 (或 1-氟萘) 回收率: 應為 65%～130%; 若不在限值之內，需要重新檢查并確認計算、替代標物準、儀器是否問題。

注意事項

苯并 (a) 芘是強致癌物，提取液濃縮及凈化過程應在通風柜中進行，必要時戴防毒面具、手套以減少對人體的危害。