熒光光譜儀原理

熒光光譜儀由激發光源、單色器、狹縫、樣品室、信號檢測放大系統和信號讀出、記錄系統組成。激發光源提供用于激發樣品的入射光的來源。單色器用來分離出所需要的單色光。信號檢測放大系統用來把熒光信號轉化為電信號，結合放大系統上的讀出裝置可顯示或記錄熒光信號。
一.激發光源

因為物質的熒光強度與激發光的強度成正比，因此一種理想的激發光源必須具備穩定的光強、足夠的強度和在所需光譜范圍內有連續的光譜，此外激發光源的輸出還應是連續平滑等強度的輻射。當然，這是理想化的光源，符合這些要求的光源實際上并不存在。通常儀器的激發光源主要采用氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、激光器以及閃光燈。高壓氙弧燈是應用最廣泛的一種光源。
熒光光譜儀所用的激發光源為450W氙燈，這是一種短弧氣體放電燈。該燈外套為石英，里面充氙氣，室溫時其壓力為5atm，工作時壓力約為20atm,氙燈的激發光譜在250～800nm呈連續光譜，在450nm附近有幾條銳線。

工作時，燈內相距約8mm的鎢絲間會形成強的電子流(電弧)，氙原子與其碰撞后會離解為氙正離子，氙正離子與電子結合就會發光。氙原子的離解發射連續光譜，而激發態的氙會發射位于450nm附近的線狀光譜。工作的時候，氙燈發射出很強的燈光，其射線會損傷眼睛視網膜，紫外線會損傷肉眼角膜，因此操作者應避免直視光源。

二.單色器

光柵和濾光片都可以作為單色器。目前，現代精密的熒光光譜儀均用光柵分光器作為單色器(簡稱光柵單色器)，單色器部分均帶有可調的狹縫，用以選擇合適的通帶。Fluorolog-3型熒光光譜儀狹縫的可調范圍通常設為1～5nm。

1．光柵

光柵單色器有兩個性能評價指標：色散能力和雜散光水平。通常，色散能力以nm/mm表示，其中mm為單色器的狹縫寬度。單色器的雜散光指標是一個極其關鍵的參數。雜散光是指除去所需要波長的光線以外，通過單色器的所有其他光線的強度。選用低雜散光的單色器可以減少雜散光的干擾，同時選用高效率的光柵單色器可以提高檢測弱信號的能力。普通光柵單色器都有進光和出光兩個狹縫，出射光的強度與光柵狹縫寬度的平方成正比。因此，適當地增大狹縫寬度有利于提高信號強度，但同時也會降低信號的分辨能力。而縮小狹縫寬度會有利于提高光譜分辨力，但卻犧牲了信號強度。因此，為保證測試的真實性，針對具體的測試體系，狹縫的調節一般從小到大。另外，對于光敏性的熒光體在測量的時候有必要適當減少入射光的強度。通常激發單色器發出的紫外線用來激發熒光體，而氙燈中的紫外線強度很弱，僅約為可見光的1％。普通熒光物質的熒光一般都很弱，所以通過激發單色器的長波長的雜散光很容易被當作熒光來檢測。例如，對于許多濁度較大的生物樣品，入射的雜散光被其散射后就會干擾熒光強度的測量。因此，有些熒光光譜儀采用雙光櫥單色器，這樣雜散光可降至峰強度的10-8～10-12,但是其靈敏度也將降低。

光柵單色器的透射率是波長的函數，定義機刻光柵的最強輸出光的波長為閃耀波長。光柵的閃耀波長是由光柵的閃耀角決定，而閃耀角由光柵的線槽角決定。為彌補激發光源(氮燈)紫外區能量弱的缺點，熒光光譜儀多選用閃耀波長在紫外區(如300mn)的單色器為激發單色器。由于熒光化合物的發射波長多分布在400～600nm，因而發射單色器常采用閃耀波長為500nm左右的光柵。此外，光柵單色器的透射率與偏振光有關。

2.濾光片

消除來自雜散光和散射光的熒光測量的主要誤差，還可以用濾光片。濾光片價格便宜、構造簡單，因此它在熒光光譜儀中得到廣泛應用。常用濾光片可分為玻璃濾光片、膠膜濾光片和干涉濾光片三種。該儀器使用的是玻璃濾光片。玻璃濾光片因為含有不同的金屬氧化物而呈現不同的顏色。它們透過的光線帶寬較寬，而且因受金屬氧化物種類的限制，品種不多。但它價格便宜，又具有穩定、經得起長期光照等優點。

三.檢測器

檢測器的種類很多，主要有光電倍增管(photomultiplier-tube, PMT)、光導攝像管、電子微分器和電荷耦合器件陣列檢測器。目前，幾乎所有熒光光譜儀都采用PMT作為檢測器。PMT是一種具有極高靈敏度和超快時間響應的將微弱光信號轉換成電信號的真空電子器件，可用于光探測器件。在一定的條件下，其輸出電流量與入射光強度成正比。檢測器R928P PMT在真空管中包括光陰極和聚焦電極、電子倍增極和電子收集極(陽極)，根據光電子發射、多級的二次發射電極和電子光學的原理制成。光陰極在光子作用下會引起一次電子發射，這些光電子在真空管中被外電場加速，聚焦飛射到第一個二次發射極。這些沖擊次級電極的光電子會使次極電極釋放更多電子(5～20個)發生二次電子發射，這些電子又被加速并聚焦在下一個電極上去，這樣重復多次，一般經過10次以上的倍增，放大倍數可達到108～1010，最后電子被集中到高電位的陽極上去，所產生的光電流就被放大到可檢測的水平。PMT的光電子產生率與施加于光陰極的高壓值的大小有關。一般PMT常用-500～-1000 V的電壓，有些PMT則用-1000～-2000V。電壓越高，每個二次電極發射的電子越多，因此PMT本身的放大作用就越大。

光導攝像管是用來作為光學多通道分析器的檢測器。它具有動態范圍寬、檢測效率高、線性響應好、堅固耐用和壽命長等優點，盡管檢測靈敏度不如PMT，但它能同時接受熒光物質的整個發射光譜，更有利于光敏性和復雜樣品的分析。電荷耦合器件陣列檢測器是一類新型的光學多通道檢測器，具有靈敏度高、噪聲低、光譜范圍和線性范圍寬、暗電流小、量子效率高，還可獲取彩色、三維圖像等特點。CCD檢測器是一種靈敏的固體成像裝置，一般其有效成像面積為1～8cm[1，2] 。

四.讀出裝置

早期熒光儀器的讀出裝置有數字電壓表、記錄儀(x-y或x-t型)和陰極示波器等幾種。現在隨著計算機軟硬件技術的發展可以根據需求選擇不同的直觀讀出方式。