靈敏度校正
熒光光度計的靈敏度可以用被檢測出的最低信號來表示,通常以硫酸奎寧的檢出限或者以純水的的拉曼峰的信噪比(S/N)表示。
熒光光度計的靈敏度與光源強度,單色器(包括透鏡,反射鏡)的性能,放大系統的特征,和光電倍增管的靈敏度有關;
與所選用的波長,狹縫寬度有關。
與被測空白溶劑的拉曼散射,激發光,雜質熒光有關。
由于影響因素多,同一型號的儀器,甚至同一臺儀器在不同時間操作,所測得的結果也不盡相同。因而在每次測定時,在選定波長和狹縫寬度的條件下,先用一種熒光性質穩定,濃度固定的標準液進行校正,將每次所測得的熒光強度調整到相同數值(50%或100%)。如果被測定的物質所產生的熒光很穩定,自身就可以作為標準溶液。紫外可見范圍內最常用的是1?g/ml(0.05mol/l 硫酸中)硫酸奎寧標準溶液。因為其產生的熒光十分穩定。
波長校正
熒光分光光度計的波長出廠前都經過了校正,若儀器的光學系統和檢測器有所變動,或較長時間使用后,或在重要部件更換后,有必要用汞燈的標準譜線對單色器刻度重新校正,這一點在要求較高的測定工作中尤為重要。
激發光譜和熒光光譜的校正
熒光分光光度計所測得的激發光譜或熒光光譜往往隨著儀器不同而不同。 原因:
單色器波長的準確度,拉曼散射光的影響,以及狹縫寬度等。
其最主要的原因有光源的強度隨波長變化 ,檢測器對不同波長光的接受敏感程度不同,檢測器的響應與光強不成線性。
由于以上原因,在用單光束儀器測定激發和發射光譜時,因為不能用參比溶液進行相對校正,誤差較大。尤其是當波長處于檢測器靈敏度曲線的陡坡時得到的“表觀光譜”中的值之間的相對關系不能反映真實情況,產生了顯著誤差。因此可先用儀器上附有的校正裝置將每一個波長的光源強度調整到一致,然后根據表觀光譜每一個波長的強度除以檢測器對每一個波長的感應強度進行校正以消除誤差。
目前生產的光度計大都是雙光束光路,可以用參比光束抵消誤差。
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