熒光原位雜交實驗——基本方案

樣品

DNA探針非同位素甲酰胺雜交混合液甲酰胺Triton X-100SSC

相差顯微鏡蓋玻片水浴鍋加濕盒濾光片熒光顯微鏡

1a.  石蠟切片或細胞的雜交：按石蠟切片或細胞的原位雜交實驗的基本方案步驟1~7，對載玻片進行脫蠟、水化、 封閉和脫水處理。將標本晾干（或在干燥器中干燥），隨后貯于加有干燥劑的載玻片盒中，置-70℃過夜。

1b.  冰凍切片的雜交：按冰凍切片的原位雜交實驗的備擇方案步驟1~7，進行切片的預處理和乙酰化處理， 隨后進行切片的脫水。

2.  對每一雜交實驗，可用乙醇沉淀10~15 ng 探針，重溶于10 ml 去離子的甲酰胺中，加5 ug（0.5 ul）超聲處理的鮭精DNA，在70~80℃溫度下熱變性探針10 min。

3.  加10 ul 主雜交混合液于變性探針中（探針終濃度為0.1~0.5 ug/ul 混勻），微量離心機以高速稍加離心，然后加于載玻片上。覆加22 mm² 蓋玻片，輕壓以趕去大的氣泡。放入加濕盒中，在37℃溫育2~4 h。

4.  雜交最后30 min 期間，以37℃水浴，在Coplin 廣口瓶中，預熱50 ml 50%甲酰胺/2xSSC洗液和50 ml 2xSSC。

5.  從加濕盒中取出載玻片，剝去橡皮泥（如有使用的話）并小心移去蓋玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2xSSC中，清冼雜交過的玻片15 min；接著以37℃ 2xSSC洗15 min；再于室溫以1xSSC洗15 min。

6.  玻片在室溫下，以4xSSC平衡5 min。取出載玻片吸去殘余緩沖液，在此過程中任何時候都不要使玻片干涸。

7.  加50 ul 生物素檢測液，地髙辛檢測液或生物素/地高辛檢測液于雜交過的載玻片上。用22 mm² 的Parafilm 膜覆蓋，放在一用鋁箔包裹的加濕盒中，于37℃溫育45 min。

8.  室溫下，按順序在裹以鋁箔的Coplin 廣口瓶中，分別用4xSSC、0.1%Triton X-100/4xSSC和4xSSC浸洗切片。毎種溶液中浸洗10 min。

9.  加50 ul DAPI 或碘化丙錠染色液于切片上，以一塊22 mm² 的Parafilm 膜覆蓋。室溫下染色5 min。在盛有1xSSC的Coplin 廣口瓶中快速浸洗，以除去多余染液。吸去殘液但不要使切片干涸。

10.  加7 ul 適當的防褪色固片介質于已染色的切片上，覆以蓋玻片。輕輕擠壓除去多余的防褪色固片介質，注意勿損傷組織切片。以指甲油密封蓋玻片，放在有干燥劑的玻片盒中，貯于-20℃。

11.  用具落射光源，以及有適合實驗中所用熒光染料的濾光片的熒光顯微鏡，觀察實驗結果。

12.  用Ektar-1000或Ektachrome-400彩色感光片照相。