3.5 雜交混合變性和雜交
( 1 ) 離心管中準備雜交液，見表14. 1，充分混合。
( 2 ) 在離心管中加入 34 μl 雜交液、2 μl 轉基因探針、1 μl 指示探針或對照探針，蒸餾水補齊至 40 μl，作為探針混合液。
( 3 ) 探針變性，放入 70°C 水浴鍋 10 min , 然后置冰上 5 min。
( 4 ) 將探針混合液滴到玻片上染色體所在位置，用塑料蓋玻片蓋好，注意去除所有氣泡，如有氣泡，需要揭開蓋玻片重新蓋上。
( 5 ) 將玻片放到加熱塊上，升溫至變性所需溫度，一般是 75°C、8 min。根據不同物種、不同制備方法和材料儲存時間的不同，變性溫度在 70~95℃ 之間，時長 6~12 min ( 見注 14)。
( 6 ) 降溫至 37℃ 放置 10~20 min , 將溫度保持在 37℃ 準備雜交。
( 7 ) 如果加熱板可以保濕，可將玻片保留在加熱板上，如果不行，將玻片轉移到烘箱的保濕盒或者水浴鍋中用于雜交。注意不要讓樣品干掉，也不要讓冷凝水積累到樣品上。過夜（16 h ) 。
3.6 嚴謹性洗滌和雜交位點檢測
( 1 ) 配制洗滌液和檢測緩沖液，見 2 . 6 節。
( 2 ) 從雜交中取出玻片，檢查樣品是否蒸干或者被冷凝水打濕。
( 3 ) 在 42℃、2X SSC 中將蓋玻片浮去，注意玻片間不要刮擦。
( 4 ) 玻片于 42℃、2X SSC 中洗滌 2 min。
( 5 ) 玻片于 42℃ 嚴謹性洗滌液中溫育兩次，每次 5 min , 準確測定并記錄洗滌液的溫度。使用 0.1% x SSC 高嚴謹度洗滌或者 2X SSC 低嚴謹度洗滌（見注8) 。
( 6 ) 玻片于 42°C 的 2x SSC 中洗滌三次。
( 7 ) 從水浴鍋中拿出玻片，自然冷卻 10~15 min。
( 8 ) 玻片轉移至檢測緩沖液放置至少 5 min。
( 9 ) 在每個玻片的記號處加入 200 μl 的 BSA , 蓋上塑料蓋玻片放置 5~30 min。
( 10 ) 根據探針標記準備檢測液（見 2. 6節），去掉 BSA , 吸取 50 μl 檢測液到玻片上 ，蓋上塑料蓋玻片，37℃ 保溫箱溫育 60 min ( 見注9) 。
( 11 ) 去掉蓋玻片，檢測緩沖液洗滌三次，每次 5 min。
3.7 復染及封片
大多數樣品需要進行 DNA 復染來觀察染色體。復染染料顏色必須與探針顏色不同，其信號也不能太亮使雜交信號模糊。因此，建議先染色再封片。一些實驗操作將復染和封片合并為一步，這樣做省了一個步驟，但是可能導致染色過度和背景值偏高。第一個熒光 FISH 實驗使用碘化丙啶染色，當用藍光或者綠光作為激發光時，染色體呈紅色。
雙靶標 FISH 實驗中，當用紅色和綠色標記熒光探針時，使用 DAPI 在紫外激發下呈藍光比較合適（圖 14.3)，因為它常常能同時顯示出異染色質帶型。在制備染色體過程中， DAPI 也是一種檢測染色體的質量和數目的很好染料，當染色體很小時它特別有用 [ 圖 14.1 (a ) ] 。
( 1 ) 向載玻片上滴入 50~100 μI 的染色液，用塑料蓋玻片蓋好，然后于室溫、黑暗下放置 10 min (見注5) 。
( 2 ) 移除蓋玻片，用檢測緩沖液短暫洗滌（ 見 4 . 2 . 6節）。
( 3 ) 吸干緩沖液，向蓋玻片上滴入一滴抗熒光淬滅封片液，然后蓋上玻璃蓋玻片。配合濾紙片用手擠壓玻片以去除多余封片液（ 見注15)。
( 4 ) 玻片觀察。淬滅劑可能需要幾個小時才能滲透至樣品中，因此可放置過夜后再進行觀察和拍照。
3.8 觀察和拍照
使用落射熒光顯微鏡觀察探針雜交點和染色體染色。本章不是對顯微鏡的使用進行說明，只是對一些常見問題和解決辦法提出如下建議。
( 1 ) 即使使用很好的熒光抗衰劑封片，熒光染料和原位雜交信號也可能非常微弱并會迅速衰減，因此顯微鏡應置于一個全黑暗房間的固定臺面上，并且擺放要便于操作。確保系統合理放置，調整光源居中。
( 2 ) 確保儀器和浸油以及 UV 為熒光專用。浸油應室溫黑暗放置。運輸車內陽光的熱量、混合油、浸油吸水等都會促使浸油自發熒光或者不透 UV。
( 3 ) —般情況下，最好使用針對單一熒光的特定濾波片。多通道濾波片也可以買到，但由于不同熒光的光強不一樣導致這種玻片不太好用，并且不同熒光間的雜交激發常使結果很難分析。確保濾波片沒有隨著使用時間的增加而發生特性改變。
( 4 ) 使用膠片或者數碼相機拍照。兩者都能獲得滿足發表標準的圖像分辨率。但是，必須注意的是，不管多貴的數碼系統都無法補償顯微鏡直接觀察的優勢。當使用膠片時，彩印膠片比幻燈片更好，因為它有更好的曝光范圍，并且價格和打印都更便宜。
( 5 ) 玻片應一直放在抗衰減劑中，這樣能極大地阻止熒光信號的衰減。
( 6 ) 記錄熒光信號前要特別小心，不要讓染色體信號尤其是微弱的 FISH 雜交信號衰減。低倍鏡下觀察一般不會衰減信號。但到 63x 和 100x 時衰減很迅速。有必要先安裝好照相系統，焦平面一旦聚焦就可迅速按下曝光鍵。先將 FISH 信號拍照記錄好，在找到滿意的 FISH 雜交信號前，不要用 DAPI 觀察染色體熒光。
( 7 ) 當觀察一個肉眼幾乎看不見的弱熒光信號時，聚焦圖像會很困難。可以在紅光和綠光焦平面之間輪換著觀察。DAPI 不便這樣操作。
( 8 ) 不論使用數碼相機還是普通膠片，使用圖像處理軟件（ 如 Adobe Photoshop、Corel Draw 或者其他類似軟件包）分析，疊加和組合各種圖片是最方便的。但是，必須注意圖片不可過度處理。責任人必須清楚地意識到對實驗室成員的圖像處理是要負責任的！
3.9 轉基因的 FISH 分析
實驗中最困難的部分可能是判斷所觀察或記錄的信號是否真實可信，尤其是低拷貝轉基因的信號。
( 1 ) 檢查有絲分裂中期是否完整，染色體形態是否保存完好。染色體可以稍顯臃腫，但不能太發散。染色體應該沒有破損，沒有洞隙或扭曲。
( 2 ) 確保對照探針有預期結果。
( 3 ) 注意觀察背景信號和非特異性交叉雜交信號，它們可能模糊掉真正的 FISH 信號 [ 圖 I 4.3 (b ) 和 圖 14.3 (c ) ] 。任何焦平面外產生清晰邊緣的信號都可以去除 [ 見圖14.3 (a ) ] 。星點狀強信號 [ 圖 14.3 ( d ) ] 常常意味著探針或檢測劑已經變質。
( 4 ) 統計染色體上的轉基因 FISH 信號。分析若干有絲分裂中期細胞，可能的話，鑒定出染色體和 FISH 信號的位置。在一個正常的二倍體細胞中，一個二倍體位點應該在同源基因所在的兩條染色質的相同位點上產生熒光信號（ 見注16)。當目的條帶小于 50 kb 時，由于染色體的螺旋和擠壓，不太可能在同一個分裂中期細胞中觀察到所有位點的信號，所以在任意某個分裂中期細胞中，不要指望看到所有的信號點。不過觀察 5~10 個或更多分裂中期細胞后，應該能確定哪個是真實信號，哪個是背景信號。當觀察到熒光強度高和可靠性好的信號時，表明幾個轉基因以串聯的方式整合到基因組中了[ [18]、[ 19 ] , 見圖 14 .3 (a ) ] 。
( 5 ) 最重要的一點是要比較同一個探針或者同一批實驗所得到的玻片，以此排除實驗失敗、實驗污染或探針標記無效、抗體稀釋度不合適或者其他試劑使用不當等因素。