1）探針變性
將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
2）標本變性
①將制備好的染色體玻片標本于50oC培養箱中烤片2～3h。（經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。
②取出玻片標本，將其浸在70～75oC的體積分數70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
③立即按順序將標本經體積分數70％、體積分數90％和體積分數100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
3）雜交
將已變性或預退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。
4）洗脫
此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。
（1） 雜交次日，將標本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50oC的體積分數50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3） 在已預熱42～50oC的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4） 在室溫下，將玻片標本于2×SSC中輕洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL復染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。
5）雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）
（1） 在玻片的雜交部位加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。
（2） 去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37oC繼續溫育40min。
（3） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
（4） 在玻片標本的雜交部位加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。
（5） 去掉保鮮膜，加150μL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。
（6） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
（7） 重復步驟(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。
（9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。
6）封片
可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在—20～—70oC的冰箱中的暗盒中保持數月之久。
7）熒光顯微鏡觀察FISH結果
先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針所在的位置發出綠色熒光。
所用不同熒光材料的激發光和發射光波長及濾光鏡選擇。