熒光定量PCR儀的關鍵參數和重要特性

熒光定量PCR儀的關鍵參數和重要特性  在選購熒光定量PCR儀時，幾個關鍵參數要注意：
   1.儀器的檢測通量（Throughput）
    首先要考慮實驗室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學舊金山分校癌癥中心的基因組分析設備負責人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數的定量PCR儀。他表示，如果不是大規模批量使用，比如說主要是用來檢測驗已知基因，那確實不需要昂貴的高端產品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點和疾病標記的實驗室，就需要能容納384孔板、運行時間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會發現樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實驗室往往需要進一步的自動化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
 
   2.多重擴增的能力 
    多重擴增越來越熱。實時定量PCR儀也不能幸免。高端定量PCR儀擁有多個檢測通道，因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道，比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產品而名滿天下的Stratagene也有一種價格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個檢測通道。不過多重擴增并非人人適用，因為它使實驗復雜化了。
 
  3．軟件 
     當你準備選擇一臺定量PCR儀，你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進行復雜計算，以前的軟件還需要你做進一步分析，新的軟件已經可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設計、多重分析設計、背景校正、數據歸一化等等。Roche應用科學部的應用和技術服務部負責人Willian Demyan 就強調：定量PCR是一個幾何擴增的過程，開始時一個拷貝之差，結果就有幾何數量級之別。
 
    4.靈活性 
    大規模繁忙的實驗室設備先進固然令人羨慕，常規的實驗室同樣可以有精彩的選擇。現在的供應商都擁有眾多的技術專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實時定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變為雙384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實驗室來說，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇，一個基本模塊有16個獨立控溫樣品槽，可以同時或者前后分別進行16個完全獨立的不同實驗， “隨機存取”；當實驗室需要較大規模實驗時，可以非常經濟地升級，從1個增加到6個基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當一個學生開始小量實驗，其他人還可以隨時插進去開始自己的獨立實驗，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實驗而且預算較緊張的實驗室來說是非常靈活的選擇。
 
    5.不確定性 
   盡管軟件可以做部分修正，購買一臺系統誤差較少的儀器，無需那么多計算修正總比靠計算修正好。Cinzinger 就認為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了眾所周知的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負責收發和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數的市售的定量PCR儀做過同樣的測試，他將同樣的樣品和反應試劑在儀器的每一孔進行實時擴增。很不幸，很多時候，不同樣品孔之間會有不同的結果。
 
    6.試劑盒的選擇 
    盡管銷售人員會吹噓有出色質量控制的試劑盒和解決方案就會得到一至的結果，但購買現成的試劑盒并不是解決差異性的辦法。認真的評估實驗和分析實驗才是解決之道。