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  • 發布時間:2020-09-01 10:12 原文鏈接: 熒光定量PCR技術特點、原理及其應用3

    3.2腫瘤研究
    意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技術檢測乳腺癌標本c-erbB-2基因拷貝數目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件,當擴增循環數在28~31之間時,△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關系。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因,發現△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關系,雖然二者斜率不同,但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發光效率不同,卻不影響定量效果。為了檢驗FQ-PCR的準確性和對不同基因拷貝數的分辨率,他們將c-erbB-2基因的DNA樣本用正常胎盤DNA做不同倍數稀釋后進行實驗,測得的結果與期望值高度相關(r=0.997)。他們將實驗數據與Southern印跡結果和已報告的競爭性PCR結果比較都顯示高度相關性(n=25,r=0.94,P〈0.01)。
    1998年法國Bieche等[8]用FQ-PCR測定了108例乳腺癌標本。他們選擇擴增頻率較高的myc、ccnd1和erbB2基因進行擴增,在108例標本中,發現10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數增加,拷貝數增加的最大值分別為4.6、18.6、15.1。同時他們又將這些數據與Southern印跡的結果進行比較,顯示了較好的相關性。
    3.3 基因表達研究
    由于TaqMan系統及熒光探針的應用,對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測骨髓基質血小板生成因子(TPO)在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發性血小板減少性紫瘢(ITP)、再生障礙性貧血(AA)和特發性血小板多癥(ET)等疾病過程中的病理生理意義,日本Hirayama等[9]用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在ABI7700反應系統測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質細胞TPO mRNA水平,又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPO mRNA水平明顯升高,而ET病人的TPO mRNA水平則正常,經類固醇治療后ITP病人TPO mRNA水平下降;骨髓TPO的濃度與其 mRNA水平有相關性;在正常人和ITP病人,TPO mRNA表達水平與巨核細胞計數也有相關性。這個實驗對闡明TPO 的作用提供了依據。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技術對鼠成肌細胞系C2C12中肌肉調節因子的表達水平及動態變化進行了研究。
    3.4 免疫組份分析
    對免疫T細胞群體V-β組份進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段,可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行 [11,12]。流式細胞法是通過對細胞群體進行直接而方便的V-β表達方面的研究,但需要一整套單克隆抗體和大量細胞來進行染色分析,而且人類V-β特異性抗體尚不完備,因此該方法有許多不便之處。如果用FQ-PCR方法,即不需要大量細胞,引物設計也很方便,而且已有多種定量方法,包括錨式PCR法、半定量PCR法、競爭性PCR法等[13,14],但都因PCR產物的后處理過程需凝膠電泳、 EB染色和光密度測量等既費時,又降低了準確性,還增加了污染機會,使得FQ-PCR的應用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技術進行實驗,從而避免了這些問題,他們在反應系統中引入熒光探針,將下游引物與探針固定,然后,針對不同的V-β成份,選用特異的上游引物進行擴增,再對反應中產生的熒光信號進行處理,即可獲得各個成份的數據。
    3.5基因突變及多態性的研究
    美國Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR 技術對正常痘病毒多態性進行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結合的引物,并設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針,用熒光標記后進行實驗,順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態的研究。
    3.6其他方面
    日本Isono[17]利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數關系的研究。他們以核基因Cab作為內參照,進行葉綠體基因rbc1拷貝數測定,結果發現子葉出現以后,葉綠體基因拷貝數顯著增加,進而把葉綠體的基因拷貝數增加與光誘導的葉綠體成熟過程聯系起來。1998年美國Higgins等[18]還建立起一套用熒光探針檢測鼠疫纖溶酶原激活基因(pla)的實驗方法。
    4 結語
    綜上所述,FQ-PCR作為一種核酸定量技術,應用較多且較成熟的主要是在病原體檢測方面,其優越性在此方面也得以充分體現。因此將該項技術進一步開發應用于臨床,具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面,尤其是基因表達的研究,該技術目前應用的還較少,在此方面加強研究應用,將會有廣闊的前景。

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