熒光實驗方法的選擇

在熒光分析中，可以采用不同的實驗方法以進行分析物質濃度的測量。其中最簡單的是直接測定的方法。只要分析物質本身法熒光，便可以通過測量其熒光強度以測定其濃度。許多有機芳族化合物和生物物質有內在的熒光性質，通常可以直接進行熒光測定。若有其他干擾物質存在時，則應預先采用掩蔽或分離的辦法加以消除。
  對于有些物質，它們或者本身不發熒光，或者因熒光量子產率很低而無法進行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。間接測定的辦法有多種，可按分析物質的具體情況加以適當的選擇。 第一種方法是熒光衍生化的辦法，即通過某種手段使本身不發光的待分析物質轉變為另一種發熒光的化合物，再通過測定該化合物的熒光強度，可間接測定待分析物質。例如許多無機金屬離子的熒光測定方法，就是通過使它們與某些金屬螯合劑反應生成具有熒光的螯合物之后加以測定的。某些不發光的有機化合物，可以通過降解反應、氧化還原反應、偶聯反應、縮合反應、酶催化反應或光化學反應等辦法，使它們轉化為熒光物質。例如維生素B1本身不發熒光，但可在堿性溶液中用鐵青化鉀等一些氧化劑將它氧化為發熒光的硫胺熒[9]。
  如果分析物質本身不發熒光，但卻具有能使某種熒光化合物熒光猝滅的能力，由于熒光猝滅的程度與分析物質的濃度有著定量的關系，那么，通過測量熒光化合物熒光強度的下降程度，便可間接地測定該分析物質。例如大多數過渡金屬離子與具有熒光性質的芳族配位體配合后，往往使配位體的熒光猝滅，從而可間接測定這些金屬離子。倘若待分析物質不發熒光，但可以通過選擇合適的熒光試劑作為能量受體，在待分析物質受激發后，通過能量轉移的辦法，經由單重態-單重態（或三重態-單重態）的能量轉移過程，將激發能傳遞給能量受體，使能量受體分子被激發，再通過測定能量受體所發射的發光強度，也可以對分析物進行間接測定。例如在濾紙上用萘作敏化劑以測定低濃度的蒽時，可使蒽的檢測限提高達3個數量級。以此類推，低濃度的菲也可由萘敏化而產生較強的熒光。在熒光分析中，由于每種熒光化合物具有本身的熒光激發光譜和發射光譜，因而在測定時相應的有激發波長和發射波長兩種參數可供選擇，這在混合物的測定方面比分光光度法具有更有利的條件，有時可簡單地通過選擇合適的激發波長或發射波長，達到選擇性測定混合物中某種組分的目的。
   在選擇激光波長和發射波長之后仍無法達到混合物中各組分的分別測定時，還可仿照分光光度法中聯合測定并解聯立方程式的辦法；對于混合物的熒光聯合測定，也有不采用聯立方程式而采用校正圖的辦法；對于發射光譜相互重疊的雙組份或三組分熒光混合物的同時測定，在合適的條件下可應用類似于雙波長分光度的原理，采用多波長熒光法進行測定。上述這些辦法提出時在當時的儀器條件下是有效的、可以解決問題的，對拓寬熒光分析的應用范圍是發揮一定作用的，但畢竟方法比較繁瑣、費時。在目前的情況下，由于熒光分析在法學和儀器方面都有了很大的發展，就不必采用上述幾種方法，而可以采用更為先進的方法，諸如本書后面將要介紹的同步熒光測定、導數熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定等方法，以及化學計量學的方法，來達到分別測定或同時測定的目的。與常規熒光分析法相比，同步熒光分析法具有簡化譜圖、提高選擇性、減少光散射干擾等特點，尤其適合多組分混合物的分析。同步熒光掃描技術由Lloyd首先提出，它與常用的熒光測定方法最大的區別是同時掃描激發和發射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發波長（或發射波長）構成光譜圖，稱為同步熒光光譜。
   根據激發和發射兩種波長在同時掃描過程中彼此間所保持的關系，同步熒光分析法可分為如下四種類型：第一種類型在同時掃描過程中使激發波長（emex????常數），這種方法稱為恒（固定）波長同步熒光分析法（constant wavelength synchronous fluorescence spectrometry, CWSFS）,即習慣上所說的同步熒光法，是最早提出的一種同步掃描技術；第二種類型則以能量關系代替波長關系，在兩個單色器同時掃描過程中使激發波長與發射波長之間保持固定的能量差，這種方法稱為恒能量同步熒光分析法(constant-energy synchronous fluorescence spectrometry,CESFS) ；第三種類型稱為可變角（或可變波長）同步熒光法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry,MISFS），其掃描路徑表現為基體（將干擾物視為基體）的等熒光強度線。
   同步熒光掃描測定具有如下優點：1簡化光譜；2窄化譜帶；3減小光譜的重疊現象；4減小散射光的影響。
  三維熒光光譜是近幾十年中發展起來的一種新的熒光分析技術。這種技術區別于普通的熒光分析的主要特點在于它能獲得激發波長與發射波長同時變化時的熒光強度信息。普通熒光分析所測得的光譜是二維譜圖，包括固定激發波長而掃描發射（即熒光測定）波長所獲得的發射光譜，和固定發射波長而掃描激發波長所獲得的激發光譜。但是，實際上熒光強度應是激發和發射這兩個波長變量的函數。描述熒光強度同時隨激發波長和發射波長變化的關系圖譜，即為三維熒光光譜。
  另外，熒光分析法還有時間分辨和相分辨熒光分析法、熒光偏振測定、低溫熒光分析法、固體表面熒光分析法、動力學熒光分析法空間分辨熒光分析技術、單分子熒光檢測、熒光免疫分析法和導數熒光分析法。固體表面熒光測有兩種方法：一種是直接測定固體物質表面的熒光；另一種是將待測組分吸附在固體物質表面，然后進行熒光測定。才用的固體物質品種眾多，有硅膠、氧化鋁、濾紙、硅酮橡膠、乙酸鈉、溴化鉀、蔗糖、纖維素等。固體表面熒光測定有兩種不同形式，一為反射式，一為透射式。采用反射式時，激發光源和熒光檢測器同在樣品的一邊，一般互成45°角。紫外激發光聚集于固體表面樣品斑點上，樣品發生的熒光經單色器散射后由檢測器檢測。采用透射式時，一般將樣品吸附在透明的薄層色譜板上，激發光源和檢測器分處在樣品的兩邊。紫外激發光經濾光片除去可見光，聚集在樣品斑點上而發可見光熒光，熒光透過薄層板再經單色器散射后由檢測器檢測。在固體表面熒光測定中，待測物質吸附在固體物質的小顆粒上。入射光進入固體物質而在顆粒的邊界上發生多重反射，成為漫反射發生的熒光也在顆粒之間發生反射，形成了激發光和熒光兩者的散射。在這樣復雜的情況下，固體表面發生的熒光強度除與照射面積和熒光物質的數量有關外，還受眾多因素的影響，如散射光強度、吸附層厚度、固體顆粒的大小、固體表面對激發光的吸收、測定的方式、觀測發光信號的角度等。