（1）打開燈源，超高壓汞燈要預熱15min才能達到最亮點。
（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的后面裝上相應的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。
（3）用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。
（4）放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。
（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，觀察到經0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。