熒光顯微鏡光源改進優化方法的簡要探討

熒光顯微鏡是目前使用頻率很高的常用實驗室儀器。如果優化從光源到樣品表面的照明是實驗室經常碰到的問題。廣州科適特科學儀器有限公司在給客戶服務過程中，根據客戶反饋和參考相關文獻，簡要總結如何優化顯微鏡熒光光源。當來自顯微鏡熒光光源在通往顯微鏡的樣品表面可能出現問題時，可以在以下部位查找可能的故障原因。

顯微鏡熒光光源與倒置熒光顯微鏡的連接。虹色標記的位置1-5對應于后續表格中用于測量的光路中的位置。
 
近年來，越來越多的LED光源被用于熒光顯微鏡成像。這些LED光源的設計克服了汞燈和金屬鹵化物弧光燈的局限性，可提供令人優越的性能，遠遠超過了早期的照明光源。LED顯微鏡熒光光源具有高信噪比（SNR）和高分辨率，增強的靈敏度和穩定性特點。可為熒光顯微鏡成像提供高質量的實驗數據，同時具有更長的使用壽命和更低的維護成本。

但是，要實現LED光源的這些優點，必須將照明器的輸出有效的傳送到顯微鏡的樣品表面。我們可以研究一下顯微鏡熒光光源是如何傳遞到顯微鏡樣品表面的。光路分析不僅可以用于優化照明效果，還可以用于解決照明中出現的問題。

顯微鏡光源光路分析
當我們發現顯微鏡樣品平面的熒光激發亮度不夠，很容易就認為光源有問題，光強不夠。但通常不一定正確。因為實際上，光路的所有中間組件都可能影響最終的樣品表面照明。解決這個問題需要考慮所有將照明器輸出傳輸到顯微鏡的光學組件的情況（請參考下圖），這些配件最終都會影響整個顯微鏡的通光率。

該表對從顯微鏡熒光光源到顯微鏡樣品表面的光通量進行了逐步分析。使用10倍物鏡（位置5A）在樣品平面上測得的光通量大概15–50 mW / mm²，基本在寬場熒光顯微鏡的需求范圍內（1–100 mW / mm²）。下圖顯示了用來測試的光源到Nikon Ti顯微鏡樣品表的光通量。

對于熒光顯微鏡應用，光源提供的輻照度在各波長下是不一樣的。這是因為熒光發射光強度取決于可用于熒光團吸收的光子數。對于相同的輻照度水平，光子數量隨波長增加。因此，在其它條件不變的情況下，375 nm激發光下產生一定熒光強度所需的輻照度是750 nm（2×375 nm）所需的輻照度的兩倍。因此，在顯微鏡光源中通常紅色光譜區域具有較低的輻射通量水平（635/22 nm；請參閱表的最右列）。

盡管表中所示的輻射通量水平對于常規的寬視野熒光顯微鏡來說是足夠使用的，但確實存在改進的機會。此類改進針對兩個主要應用需求。首先，要在較短的時間間隔內獲取更多圖像而又不影響信噪比，則需要來自光源的較高輻射度和較短的相機曝光時間。第二，許多用于提高寬視野熒光顯微鏡的空間分辨率的技術會增加光學濾片。由濾片引起的損耗必須通過增加光源的輸出來補償。

改進方法探討

我們參考表中光路，簡要地研究實現這些改進的方法。
1. 激光光源：與本文舉例使用的LED熒光光源不同，采用固態二極管激光光源來提高輸出光功率。
2. 液體光導管。液體光導可以減少顯微鏡熒光光源引起顯微鏡振動。它也可以使光源可以放在遠離顯微鏡的位置，避免操作空間太擁擠。但是，液體光導管會降低顯微鏡熒光光源輸出，損耗35％到50％的光強。可以選擇較大直徑（例如5mm光導管代替3mm）的液體光導管提高輻照度，這通常需要重新設計顯微鏡光路以將增加的光強傳播到樣品平面。
3. 準直鏡：與基于消色差透鏡的傳統設計相比，采用復眼透鏡的準直儀可提供出色的光通量和空間均勻性。
4. 物鏡：在落射熒光顯微鏡中，熒光強度與物鏡數值孔徑（NA）相關，物鏡的數值孔徑越大，熒光強度也增加。因此，選擇大數值孔徑的物鏡，同時具有足夠的工作距離能夠獲得更好的熒光效果。
總體來說，熒光顯微鏡的照明光源技術不斷在發展。傳統的弧光燈有很多缺點，包括它們含有有毒的汞蒸氣。LED光源由于光強的不斷改進，已經能夠滿足大部分熒光成像的要求。但是，按照上面介紹的分析步驟進行操作，將有助于顯微鏡用戶理解光源與顯微鏡是如何一起工作的，并有助于找到光源及成像問題的原因。

參考文獻
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