熒光顯微鏡技術原理和方法

)訓練目的

    學習熒光顯微鏡的使用；了解熒光顯微鏡技術原理和方法。

2)實驗材料

    生物素標記的一dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的duUTP(Digoxingening—11一dullP)1 nmol／μL,TdT酶(25 U／μL)，反應緩沖液，洗滌緩沖液，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗體(1：30)，PI染液(含PI 5μg/mL)，PBS緩沖液，蓋玻片，培養的貼壁細胞，懸浮細胞的甩片或涂片，冰凍切片，常規石蠟切片。

3)操作步驟

①固定：培養細胞的制片或冰凍切片用4％多聚甲醛固定30 min(4℃冰箱)后，用80％酒精再固定2 h(一20℃冰箱)；常規4％中性福爾馬林固定、石蠟切片進行脫蠟、水合。

②洗滌：將玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5 min，洗3次。

③反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μL／cm2滴加反應液(每50μL反應液含TdT酶O．5μL，標記的一dUTP 1μL)，使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1 h。

④終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置于盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌2次，每次5 min。

⑤FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μL／cm2滴加FITC反應液(含FlTC 2．5μg／mL)，室溫下避光孵育10 min。

⑥洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗2次，每次5 min。

⑦PI復染：將玻片置于盛有Pl染液的染色缸內，室溫下避光染色30 min。

⑧封片：用蓋玻片直接蓋在含PJ染液的玻片上，也可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，鏡檢觀察。

4)結果判斷

    用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發光(波長488 nm)，所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上FITC，顯示出黃綠色熒光。