熒光顯微鏡標本制作原理概述

免疫熒光細胞化學的基本工具是熒光顯微鏡。它的主要部件是光源、濾板系統和光學系統等。熒光顯微鏡制作標本的原理是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。

（一）光源

熒光顯微鏡多采用200 W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作而成，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15 min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外線和藍紫光，來激發各類熒光物質，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

超高壓汞燈也散發大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。

新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動（約為15000 V），啟動后，維持工作電壓一般為50～60 V，工作電流約4 A左右。200 W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2 h的情況下約為200 h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20 min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要等15 min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。

超高壓汞燈（100 W或200 W）光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的系統，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。

國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200 h以上，價格也比較低。

我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應用。

（二）濾色系統

濾色系統是熒光顯微鏡的重要組成部位，由激發濾板和壓制濾板兩部分組成。濾板型號，各廠家名稱常不統一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，后面字母代表玻璃，數字代表型號特點。如德國產品（Schott）BG 12，就是種藍色玻璃，B是藍色的*個字母，G是玻璃的*個字母；我國產品的名稱已統一用拼音字母表示，如相當于BG 12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的*個字母，B是玻璃拼音的*個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K 530，就是表示壓制濾長530 nm以下的光而透過530 nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當于BG 12。

1．激發濾板根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長范圍的激發光。

紫外光激發濾板：此濾板可使400 nm以下的紫外光透過，阻擋400 nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450 nm范圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

紫藍光激發濾板：它可使350～490 nm的光通過。常用型號為QB 24 （BG12）。

最大吸收峰在500 nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。

近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對性強，波長適當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP 490濾板和羅達明的S 546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。

激發濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

2．壓制濾板壓制濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應濾長范圍的熒光。與激發濾板相對應，常用以下3種壓制濾板：

紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K 510。

（三）反光鏡

反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。

（四）聚光鏡

專為熒光顯微鏡設計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

1．明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。

2．暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發光也不進入目鏡，可以使用薄的激發濾板，增強激發光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發時，可用無色濾板（不透過紫外光）而仍然產生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質量，觀察舒適，可能發現亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。

3．相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

（五）物鏡

各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。

（六）目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

（七）落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分（紫外和紫藍）由于濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45度傾斜時，則垂直射向物鏡，經物鏡射向標本，使標本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，波長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發濾板作用，由于標本的熒光處在可見光長波區，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀察。