熒光顯微鏡檢測支原體

1) 準備下列液體，然后除菌并冷藏。

無酚紅的 HBSS

NaCl                                   8 g
KCl                                     0.4 g
CaCl₂                                0.14 g
MgSO₄?7 H₂O                  0.1g
MgCl₂?6 H₂O                   0.1g
Na₂ HPO₄?2 H₂O           0.06 g
KH₂PO₄                           0.06 g
葡萄糖                              1.0 g
NaHCO₃                          0.35 g
dH₂O                               1000 ml

Hoechst 1000x 貯存液

檸檬酸/磷酸鹽緩沖液（2X)

0.1mol/L 檸檬酸                         22.2 ml
0.2mol/LNa₂ HPO₄                   27.8 ml
用檸檬酸或 Na₂ HPO₄ 調節 pH 為 5.5。

2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化細胞于培養皿中的 Labtek 玻片上或蓋玻片。

3) 加人 1~2 ml 培養液覆蓋表面，讓細胞生長 2~3 天。

4) 準備 Camoy 固定液（應在每次用前制備新鮮的)。

Camoy 固定液
3 份甲醇
1 份冰乙酸

5) 吸干培養液，不用洗涂單層細胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室內或培養皿中。培養皿中充滿 Camoy 固定液（約 5 ml）室溫中放置平皿 2 分鐘。

6) 去除培養皿中液體，加人新鮮固定液以充滿室內或培養皿中（約 5 ml)。室溫中放置平皿 5 分鐘。

7) 重復歩驟 6。

8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或將培養皿的玻片拿出，讓細胞在室溫中晾干 30 分鐘或更長。

9) 用 Hoechst1000x 儲存液（步驟 1) 配制 Hoechst 工作液。

Hoechst 工作液

工作液宜每次新鮮配制

用 10ml HBSS 稀釋 0.1 ml Hoechst 儲存液（0.5ug/ml)

用 5 ml HESS 稀釋 0.5 ml Hoechst 儲存液（0.05ug/ml)

或

用 50 mlHBSS 稀釋 50ul Hoechst1000x 儲存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。

10) 室溫條件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（終濃度為 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分鐘。

11) 用 dH₂O 漂洗兩次。

12) 等體積混和甘油、梓檬酸/磷酸緩沖液（在步驟 1 中制備），制備封閉培養液以覆蓋住細胞。

13) 在玻片和蓋玻片之間加入 2 滴封閉培養液，用紙巾輕輕吸出多余液體。

14) 用橡膠黏合劑封閉玻片和蓋玻片。

15) 用熒光顯微鏡觀察標本。應用激發波長為 330/380nm 和光柵過濾器 LP440nm。