熒光檢測支原體

來自于7天單層培養的無抗生素的細胞培養上清液或經離心后的上清液指示細胞

Hoechst 33258 染料BSS-PRD-PBSA去離子水固定劑封固劑

培養皿

1. 將指示細胞（如 3T6，NRK，Vero，A549）接種于培養皿（6 cm 直徑）中，不要使用抗生素，接種的細胞數可以在 4~5 天產生 50%~60% 的匯合層就足夠了（如 2×10⁴ NRK或 1×10⁵ A549 在 5 ml 培養液中）。

2. 加入來自所測試培養物的 1.5 ml 培養液。

3. 將上述培養物進行孵育直至細胞達到 50%~60% 匯合。

4. 移去培養液，并廢棄之。

5. 用 BSS-PR （無酚紅的 Hanks’BSS）或 D-PBSA （無 Ca²⁺，Mg²⁺ 的 Dulbecco’sPBSA）沖洗單層培養物，將沖洗液廢棄。

6. 加入新鮮 BSS-PR 或 D-PBSA 按 50：50 的比例用固定液（新鮮制備的冰醋酸：甲醇（1：3，置冰上））稀釋，沖洗單層培養物，廢棄沖洗液。

7. 加入純固定液，沖洗，廢棄沖洗液。

8. 加入更多固定液（約 0.5 ml/cm²），固定 10 min。

9. 移去固定液，并將固定液廢棄。

10. 如果準備貯存，則將單層培養物完全干燥（可在這個階段積累標本，以后再染色）。

11. 如果你要直接進行染色，可用去離子水沖洗，并廢棄沖洗液。

12. 在 BSS-PR 或 D-PBSA 溶液中加入 Hoechet 33258（Hoechst 33258 染料，50 ng/ml 溶于未加入酚紅的 BSS （BSS-PR）或 D-PBSA），在室溫下染色 10 min 。

13. 移去染色液，并將其廢棄。

14. 用水沖洗單層培養物，廢棄沖洗液。

15. 加一滴封固劑（緩沖液配制的甘油溶液）封固蓋玻片，擦去來自蓋玻片邊緣的多余封固劑。

16. 用 330/380 nm 激光濾片和 LP 440 nm 屏障濾片，對單層培養物進行熒光檢査。

如果培養物在測定結束前達到完全匯合， 染色將被抑制， 支原體的觀察很困難。