熒光素酶的作用原理及應用

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產生生物熒光的酶的總稱。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過程中，會發出生物熒光。然后可以通過熒光測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達，是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用的一種檢測方法。
目前，最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。其中螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應目的基因表達的改變，腎熒光素酶作為內參基因，為實驗提供統一基準線（減少內在變化因素如培養細胞的數目，細胞轉染和裂解的效率對實驗準確性的影響）。
實驗原理
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化熒光素氧化，生成氧化熒光素，同時產生黃綠色光，波長540-600nm。
腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產生藍光，波長460-540nm，一般檢測時選用460nm
利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。
應用類型
由于兩種酶底物和發光顏色的區別，且在動物體內無內源性表達，使其雙報告基因系統在基因調控、非編碼RNA靶向互作等研究領域得到廣泛應用。
啟動子研究：轉錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用，將目的基因啟動子區序列替換報告基因F-Luc的啟動子，通過共表達轉錄因子后，報告基因表達的改變，來確定轉錄因子與靶基因啟動子結合位點及對靶基因的作用。

miRNA研究：主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結合位點突變型）序列構建至載體報告基因螢火蟲熒光素酶的3’端，通過比較過表達miRNA后，報告基因表達的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

熒光素酶檢測試劑盒(螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶由于都是非分泌型蛋白，所以在檢測之前需要對過表達細胞進行裂解處理)：

熒光素酶報告基因載體：