細胞內pH在各種細胞事件中起重要的調節作用，包括細胞生長，鈣調節，酶活性，受體介導的信號轉導，離子轉運，內吞作用，趨化作用，細胞粘附等等。借助pH敏感的熒光指示劑，研究人員能夠以更高的靈敏度、空間分辨率、采樣密度來監控活細胞內的pH波動。
通常，細胞的細胞內pH在其各個細胞區室之間會有所不同。例如，胞質溶膠的pH值介于6.8至7.4之間，而酸性細胞器（如溶酶體）的pH值介于4.5至6.0之間。因此，選擇pH指示劑時，重要的是使其酸度系數（pKa）與實驗系統的pH相匹配，我們提供多種熒光pH指示劑，pH指示劑葡聚糖結合物和其他試劑，用于生物系統中的pH的檢測。
1. 近中性pH的檢測
BCECF及其膜滲透性AM酯是用于測量細胞內pH的最廣泛使用的熒光pH指示劑。它的pKa約為6.98，非常適合測量各種細胞類型的胞質中的pH變化，以及監測近中性環境中的pH變化。BCECF在?504 nm處有一個最大吸收，在?440 nm處有一個等吸收點，在?527 nm處有最大發射。盡管BCECF具有雙重激發的比值特性，但一些特性使比值成像不理想。其等吸收點與最大激發之間距離較大，細胞內保留性較差以及在440 nm處的弱吸收，都導致其信噪比較低。此外，BCECF以異構體的復雜混合物形式提供。
RatioWorks?BCFL，BCECF的高性能替代產品
RatioWorks?BCFL是AAT Bioquest設計的新型比值型指示劑，用于優化BCECF的不良性能和異構變異性，與BCECF相似，RatioWorks?BCFL的pKa約為7，最大吸收在503 nm處，最大發射在528 nm處。但是，RatioWorks?BCFL具有約454 nm的等吸收點，等吸收點的這個紅移非常適合比值成像，因為它使RatioWorks?BCFL產生的信噪比明顯高于BCECF。
RatioWorks?BCFL比值型成像技術使細胞內pH值測定基本上獨立于幾個可變因素，包括染料濃度，光程長度，細胞滲漏和光漂白速率。RatioWorks?BCFL可以作為不滲透膜的酸使用，也可以作為胺反應性琥珀酰亞胺酯用于標記抗體和蛋白質。
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| BCFL激發光譜 | BCFL發射光譜 |
RatioWorks?BCFL的主要功能：
適用于細胞內pH的單波長成像和比值型成像
信噪比較BCECF高
改善了細胞保留能力，將背景干擾降至最低
單一異構體設計可提供更一致和可重現的結果
適用于熒光顯微鏡，流式細胞儀和基于熒光酶標儀的測定
圖1. 使用RatioWorks?BCFL，AM（Cat# 21190）和BCECF，AM（Cat#
21202）產生的標準曲線。將Hela細胞與5 μM RatioWorks?BCFL，AM在37°C下孵育30分鐘。用Spexyte?
Intracellular pH Calibration Buffer Kit（Cat#
21235）中的細胞外緩沖液固定細胞內pH在4.5-8.5之間，取4個數據點的平均值，并用4參數擬合曲線，得到pH 6到8的標準曲線。