實驗方法原理
TIL 是繼LAK 之后的第2 代抗腫瘤效應細胞，是近來實驗研究及臨床應用的熱點之一。目前常規加入IL- 2對TIL 進行培養，但是隨著培養時間的延長，TIL 的增殖活性和抗腫瘤活性都有所降低。
實驗材料 荷瘤小鼠
試劑、試劑盒 RPMI 1640 培養液小牛血清
儀器、耗材 剪刀離心管離心機
實驗步驟
1. TIL的分離及培養
（1）取荷瘤小鼠20只，處死后無菌條件下切除皮下瘤塊，置于RPMI 1640培養液中，剔除壞死的腫瘤組織及表面結締組織，剪碎過細胞篩收集單細胞懸液。
（2）將等體積的比重1.088及1.075淋巴細胞分離液及細胞懸液先后分別置于離心管中進行不連續密度梯度離心，經1800 r/min 離心20 min 后，1.075界面上為富含腫瘤細胞懸液，1.088與1.075之間界面為富含TIL懸液。
（3）收集TIL，用含10%小牛血清，IL-2100 u/ml RPMI1640培養液稀釋調整細胞濃度成5×105/ml進行培養，分兩組。
（4）一組每5天加入冷凍瘤苗，濃度為效應細胞/腫瘤細胞（E/T）=50/1，另一組不加冷凍瘤苗進行常規培養。
（5）培養條件為37℃，5%CO2，每5天計數1次，維持細胞濃度5×105/ml。
2. 冷凍瘤苗的制備
（1）取腫瘤細胞懸液，用RPMI 1640培養液稀釋成1×105/ml 裝于凍存管中
（2）用液氮速凍慢融3個凍融周期，置于-20℃冰箱中貯存，備用。
3. 荷瘤小鼠模型的制備
（1）抽取腹水型Hepa種鼠腹水，用生理鹽水稀釋至腫瘤細胞1×106/ml，于小鼠右側腋窩皮下接種0.2 ml。
（2）1周后腫瘤長至直徑約0.5 cm 左右即制成小鼠荷瘤模型供檢測TIL抗腫瘤作用。
（3）待腫瘤生長至直徑1~2 cm 時供分離TIL使用。
4. 培養后TIL的抗腫瘤作用分3組，每組20只小鼠。對照組瘤體內注射生理鹽水0.2 ml；實驗1組，瘤體內注射常規培養TIL1×106個；實驗2組，瘤體內注射加入冷凍瘤苗培養TIL1×106個。隔3天注射1次，共6次。
5. 病理檢查處死小鼠，測量腫瘤大小，結果用垂直方向直徑平均值表示。腫瘤組織送病理檢查，常規HE染色。淋巴細胞浸潤程度根據Anneroth等的標準分為4級。0級為無浸潤；Ⅰ級為淋巴細胞浸潤僅限于腫瘤灶周圍，面積不超過腫瘤25%；Ⅱ級為淋巴細胞向瘤灶中央浸潤，面積占腫瘤25%~50%；Ⅲ級為淋巴細胞浸潤面積超過腫瘤50%。
6. 統計學方法采用t檢驗和X2檢驗。
其他
一、討論
用腫瘤特異性T細胞治療人類惡性腫瘤的一個主要問題是如何獲得具有腫瘤特異殺傷力并能在體外擴增足夠數量的T淋巴細胞，目前大多數實驗室制備TIL是采用機械分離、酶消化、不連續密度梯度離心三步法對實體腫瘤組織進行分離，此法可獲得數量較多的TIL，但細胞的增殖速度及活性均較低。
本研究使用的是直接分離法，此法省去了酶消化一步，操作簡單，節省了酶劑及時間，雖然分離的TIL數量較少，但增殖速度快及活性高，兩法在培養后期所獲細胞的抗腫瘤活性并無差異。因此，在腫瘤標本
較大、結締組織較少時是一種較為理想的TIL制備方法。
新鮮分離的TIL對絲裂原無或僅有輕微的增殖反應，對自體、同種異體及其他腫瘤細胞系的殺傷作用極弱或缺如，體外培養加入IL-2可改變TIL的抑制狀態。
本研究觀察到，經過4~5 d 靜止期后常規培養TIL才開始逐漸增殖即與TIL低活性狀態逐漸改善有關。T細胞表達IL-2受體需要抗原的不斷刺激才能維持，去除刺激后，其表達的IL-2受體逐漸減少，對IL-2的反應性和增殖能力也隨之降低。
殘存的腫瘤細胞在TIL培養中具有體外繼續致敏及對T淋巴細胞刺激增殖作用，使TIL轉化成特異性T殺傷細胞。IL-2培養TIL后期腫瘤細胞逐漸死亡及消失，使TIL增殖失去了其可能的刺激原，增殖力下降。因此，本研究中常規TIL培養組細胞增殖力弱，存活時間短與此有關。
冷凍不僅能殺滅腫瘤細胞，而且還可以使冷凍損傷的腫瘤組織成為抗原刺激物，激發抗腫瘤免疫，經冷凍滅活的腫瘤細胞所釋放的抗原量比放射線、激光照射滅活癌細胞所釋放的抗原量高。本實驗觀察到加入冷凍瘤苗后TIL經過3~4 d 靜止期后開始增殖，所需時間比常規培養TIL短，并且能長期培養，大量擴增，存活時間顯著長于常規培養TIL，與上述理論一致。
本研究中，大體病理可見兩組TIL治療后腫瘤生長緩慢，直徑較生理鹽水治療組小，差異有顯著性，說明TIL具有抗腫瘤作用，在一定程度上能延緩腫瘤生長。經冷凍瘤苗刺激TIL治療后腫瘤有縮小消退現象，而常規培養TIL治療組則無，提示前者的抗腫瘤作用強于后者，并且有質的差別。
鏡下觀察到：冷凍瘤苗刺激培養TIL治療組腫瘤有完全壞死現象，有大量淋巴細胞浸潤者均為腫瘤縮小或穩定荷瘤小鼠；而常規培養TIL治療組則無腫瘤完全壞死現象，僅少到中量淋巴細胞浸潤，說明前者抗腫瘤作用強于后者，且抗腫瘤作用與淋巴細胞浸潤程度有關，淋巴細胞多者抗腫瘤作用強，也提示離開體外培養體系后TIL仍能在體內存活并發揮抗腫瘤作用。
相比之下，對照組腫瘤灶狀壞死，無或僅少量淋巴細胞浸潤，小血管充血出血，說明趨向惡化。另外，從腫瘤周邊纖維母細胞增生情況也可說明經TIL治療后腫瘤擴散受到限制。
生物治療的特點之一是顯效時間慢，通常需要經過較長時間的觀察才能見到明顯治療效果，因此本實驗中經冷凍瘤苗刺激TIL治療后，小鼠腫瘤逐漸消退或保持穩定，大體觀變化不顯著，但鏡下可見腫瘤全部壞死或僅殘余極少數，壞死組織被機體吸收需要一個過程，如果進一步延長觀察時間，則會有更多的腫瘤消退甚至完全消失而痊愈的現象出現。
本研究結果表明，冷凍瘤苗能保持培養的TIL的增殖能力，并提高TIL在小鼠體內的抗腫瘤作用，為臨床上應用TIL治療腫瘤提供了重要的實驗依據。